[發明專利]青蒿醛雙鍵還原酶DBR1及其重組菌在制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用

有效

• 申請號: 201710332991.7
• 申請日: 2017-05-12
• 公開（公告）號: CN107142287B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 趙林果;張雪松;廖石勇;湯鋒;裴建軍
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12P7/26
• 分類號: C12P7/26;C12N15/53
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

青蒿醛雙鍵還原酶DBR1及其重組菌在制備二氫?β?紫羅蘭酮中的應用，該酶或其基因重組菌可以高效轉化β?紫羅蘭酮制備二氫?β?紫羅蘭酮。在加入40μL 1mol/L IPTG，初始OD600為1.8，加入250μL 250mmol/Lβ?紫羅蘭酮?乙醇溶液在27℃條件下全細胞轉化18小時，二氫?β?紫羅蘭酮產量達308.3mg/L。酶轉化反應體系為500μL，其中β?紫羅蘭酮濃度為1mmol/L，酶添加量約為30U/mg，反應在pH 6.5，45℃下反應60min，二氫β?紫羅蘭酮濃度為76.49mg/L，底物有效轉化率為78.77%。

技術領域

本發明屬于天然芳香單體物質制備領域，具體涉及一種青蒿醛雙鍵還原酶DBR1及其重組菌在制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用。

背景技術

紫羅蘭酮類化合物作為調香中不可缺少的原香料，大量的使用于幾乎所有的日用香精配方中。據相關資料統計，紫羅蘭酮類香料我國生產能力相對較弱，且品種規格單調，絕大多數為紫羅蘭酮和甲基紫羅蘭酮，遠不能滿足市場需求。二氫-β-紫羅蘭酮，俗稱“桂花王”，是桂花精油中一種主要的香氣物質，其香味醇厚、甘甜，具有新鮮柏木香型。目前二氫-β-紫羅蘭酮的生產大多來自于化學合成，不僅生產成本較高，效益低，而且不能作為一種天然的產品進行銷售，其合成產物的效果和“非天然性”的安全性則難以滿足食品和天然日化行業的需求。而從芳香植物中提取則存在成本高、缺乏有效的產物分離手段，并且極大的受限于農業種植以及所有能對農業種植產生影響的諸多因素。通過現代合成生物學生產諸如二氫-β-紫羅蘭酮等芳香類物質是一個嶄新的可持續生產方式。該法是模擬天然植物代謝過程生產出芳香化合物，這些化合物已被歐洲和美國定義為“天然的”并被認為是生產較安全的、高生物活性的香味化合物及其復合物最有前途的方法。

以β-紫羅蘭酮為底物，利用現代合成生物學制備二氫-β-紫羅蘭酮核心的關鍵技術就是需要找到高效的轉化酶，國內外還沒有相關的研究報導。僅僅是有一些轉化不飽和醛酮的相關酶及其基因方面的研究報導，但是酶具有專一性，且有些酶屬于絕對專一性，底物的結構不同，甚至有細微的差異都會影響到酶學的特性及轉化的效率。而且，天然產物的合成生物學或生物催化轉化來源的酶可以打破種的界限，可以來源于本身植物中酶，也可以來源于其它植物的酶，甚至是來源于微生物的酶。二氫-β-紫羅蘭酮俗稱“桂花王”，是植物桂花中的特征的香氣物質，桂花植物中存在一種生物酶，可以將β-紫羅蘭酮轉化為二氫-β-紫羅蘭酮。但通過大量的篩選和研究，有望能獲得顯著高于原來植物中的轉化水平。2006年美國加州大學伯克利分校的Keasling實驗室將來源于不同生物的基因進行設計、組裝，最后在酵母中構建了一條非天然的代謝途徑用于大量合成青蒿素的前體—青蒿酸。2010年Ajikumar等在大腸桿菌中重建紫杉二烯的合成途徑，成功獲得了這一紫杉醇的中間體。

本發明模擬天然植物代謝過程，在植物體外生物轉化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮，并首次發現了一種具有較高轉化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮能力的非桂花植物來源的雙鍵還原酶基因，在此基礎上，通過基因工程技術獲得催化性能穩定的基因重組菌pET-28a-DBR1。該重組菌及其分泌的酶對β-紫羅蘭酮環外雙鍵有較強的催化加氫能力。本發明建立了一種能在植物體外高效生物轉化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮的方法。

發明內容

解決的技術問題：本發明提供一種青蒿醛雙鍵還原酶DBR1及其重組菌在制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用，突破了在植物體外生物轉化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮技術瓶頸，從大量的雙鍵還原酶中篩選獲得了一種能高效轉化β-紫羅蘭酮制備二氫β-紫羅蘭酮的生物酶。同時，首次建立了全細胞轉化及酶法轉化β-紫羅蘭酮制備二氫β-紫羅蘭酮技術體系，實現了體外制備二氫β-紫羅蘭酮的可持續、低成本、高得率的綠色生產方式。

技術方案：青蒿醛雙鍵還原酶DBR1或其重組菌在體外轉化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用。

上述青蒿醛雙鍵還原酶DBR1的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。