[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細胞胚胎的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710328848.0
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN106973795A
• 公開（公告）日: 2017-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂秀立;尹麗娟;郭小芳;施季森;沈烈英
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市園林科學規(guī)劃研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 上海驍象知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31315
• 代理人: 趙俊寅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學領(lǐng)域，涉及巖白菜屬的厚葉巖白菜，是一種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細胞胚胎的方法。

背景技術(shù)

厚葉巖白菜(Bergenia crassifolia(L.)Fritsch)為虎耳草科巖白菜屬多年生常綠草本，是該屬中形體較大種類，國內(nèi)野生種僅見分布于新疆阿爾泰山，極早春開花，冬季葉片呈紫紅色，花葉俱美。全草含有巖白菜素，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的特效藥。自然狀態(tài)下，厚葉巖白菜主要靠分株或籽播繁殖，繁殖率低。野生資源被過度的采挖利用，資源日趨瀕危。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細胞胚胎的方法。所述的這種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細胞胚胎的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中，厚葉巖白菜繁殖率低的技術(shù)問題，并為遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細胞胚胎的方法，包括如下步驟：

1)誘導(dǎo)愈傷組織：取無菌試管苗形態(tài)學上端第二對、第三對葉片，修剪葉片邊緣出現(xiàn)傷口，葉片遠軸面朝下放于MS+2,4-D 0.1～1.0mg/L+KT 0.01～0.1mg/L+V_C 0.05～1.0mg/L培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)25～35天；

2)增殖愈傷組織：剝離誘導(dǎo)出的愈傷組織，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基MS+ZT 0.5～2.0mg/L+NAA 0.01～0.1mg/L+V_C 0.05～1.0mg/L，黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)25～35天；

3)誘導(dǎo)體細胞胚胎：將愈傷組織轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+ZT 0.1～2.0mg/L+IBA0.01～0.1mg/L+V_C 0.05～1.0mg/L，黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)55～65天，誘導(dǎo)出體細胞胚胎后，再轉(zhuǎn)移至光照下培養(yǎng)。

進一步的，誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，2,4-D濃度可以為0.1～1.0mg/L區(qū)間的任一濃度；KT濃度可以為0.01～0.1mg/L區(qū)間的任一濃度；V_C濃度可以為0.05～1.0mg/L區(qū)間的任一濃度。其中最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.1mg/L+V_C 0.5mg/L，黑暗培養(yǎng)30天。

進一步的，愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，ZT濃度可以為0.5～2.0mg/L區(qū)間的任一濃度；NAA濃度可以為0.01～0.1mg/L區(qū)間的任一濃度；V_C濃度可以為0.05～1.0mg/L區(qū)間的任一濃度。其最佳愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+ZT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+V_C 0.5mg/L，黑暗培養(yǎng)30天。

進一步的，誘導(dǎo)體細胞胚胎的培養(yǎng)基中，ZT濃度可以為0.1～2.0mg/L區(qū)間的任一濃度；IBA濃度可以為0.01～0.1mg/L區(qū)間的任一濃度；V_C濃度可以為0.05～1.0mg/L區(qū)間的任一濃度。其最佳誘導(dǎo)體細胞胚胎培養(yǎng)基為MS+ZT 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+V_C 0.5mg/L，黑暗培養(yǎng)60天。

進一步的，上述各種培養(yǎng)基，其pH值為5.6～5.9區(qū)間的任一數(shù)值；蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為2.5％～3.5％區(qū)間的任一數(shù)值；瓊脂的質(zhì)量百分比濃度為0.55％～0.75％區(qū)間的任一數(shù)值。

厚葉巖白菜作為用途較廣的中藥材，需求量不斷攀升，形體的大小、生長速度快慢、生態(tài)適應(yīng)性及巖白菜素含量高低是決定其能否推廣的幾個重要因素。本發(fā)明建立了愈傷組織發(fā)生途徑，首次誘導(dǎo)出了巖白菜屬體細胞胚胎，為今后擴繁推廣、遺傳轉(zhuǎn)化及倍性育種培育新品種奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，技術(shù)效果是積極和明顯的，并具有獨特性、新穎性和創(chuàng)新性。本發(fā)明以厚葉巖白菜無菌苗的嫩葉為起始材料，誘導(dǎo)出愈傷組織，進而誘導(dǎo)出體細胞胚胎，分化率最高為26.67％，為遺傳轉(zhuǎn)化及倍性育種奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是厚葉巖白菜愈傷組織的照片。

圖2是厚葉巖白菜體細胞胚的照片。

圖3是厚葉巖白菜子葉胚的照片。

圖4是厚葉巖白菜子葉胚切片。

具體實施方式

下述實施例中的縮略詞中英文對照表

下述實施例中每種處理調(diào)查30個，統(tǒng)計誘導(dǎo)愈傷組織率、愈傷組織增重倍數(shù)、體細胞胚胎誘導(dǎo)率。除特別說明外，每種處理重復(fù)3次。