[發明專利]一種從酵母發酵液中分離人血白蛋白的混合模式層析方法

有效

• 申請號: 201710317433.3
• 申請日: 2017-05-05
• 公開（公告）號: CN107033236B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 林東強;褚文寧;吳啟賜;姚善涇
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/16
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發明公開了一種從酵母發酵液中分離人血白蛋白的混合模式層析方法，屬于生物化工領域中的蛋白質層析分離技術。具體步驟如下：1)發酵液預處理，取含有人血白蛋白的酵母發酵液，離心去除酵母細胞，加入辛酸鈉，加熱，去除雜蛋白和滅活蛋白酶，離心分離，取上清液；2)柱層析，采用色氨酸為配基的混合模式介質，固定床層析分離上清液，上樣pH值4.0～4.5，洗脫pH值7.0～9.0，收集洗脫峰。3)脫鹽和干燥，將收集液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的人血白蛋白。本發明的特色在于開發了一種新的分離工藝，可以從酵母發酵液中直接分離得到高純度的人血白蛋白。方法的關鍵在于采用了以色氨酸為配基的混合模式介質，酵母發酵液無需調整離子強度，酸性條件下吸附，中性和弱堿性洗脫，具有洗脫條件溫和、工藝簡單、分離效率高、收率高的特點。

技術領域

本發明屬于蛋白質分離技術領域，涉及一種從酵母發酵液中分離人血白蛋白的混合模式層析方法。

背景技術

人血白蛋白是人體血漿中含量最豐富的蛋白質，約占血漿蛋白60％，主要生理功能是維持血漿滲透壓，結合以及運輸營養物質。臨床用于治療失血性休克、創傷性休克、急性血容量減少和低白蛋白血癥等。還可作為細胞培養的添加成分、藥物輔劑、賦形劑等，具有廣泛的應用價值。

臨床使用的人血白蛋白產品主要是從人源血漿中提取純化，制備方法包括冷乙醇沉淀、硫酸銨沉淀、利凡諾沉淀、辛酸鹽沉淀、層析等，原料緊張，分離復雜，且不能排除病毒或其它潛在致病因子的影響。利用現代生物技術構筑表達重組人血白蛋白的酵母細胞，可避免病毒感染，解決血源供應緊張等問題，具有良好的應用前景。但是，藥用人血白蛋白的純度要求高，而酵母發酵液組分復雜，含有蛋白酶、雜蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及熱原物質等多種雜質，必須采用多步層析方法才能去除。

酵母發酵液一般pH約6.0，電導為15～25mS/cm。專利CN1127299和US5521287利用加熱、稀釋、調酸、陽離子交換層析、疏水作用層析、金屬螯合層析、陰離子交換層析、硼酸鈣沉淀等步驟，得到純度較高的人血白蛋白。專利US5962649用陽離子交換擴張床吸附替代陽離子交換層析，縮短了工藝。不過，以上兩種方法均采用陽離子交換層析捕獲人血白蛋白，分離選擇性有限，同時料液需要稀釋處理，使得目標物濃度下降，吸附容量降低，處理量增大，過程時間延長。專利CN1854155公開了一種Capto MMC介質在酸性條件下捕獲人血白蛋白，高鹽淋洗去除雜質，中性且加鹽條件下洗脫得到人血白蛋白，該方法得到的白蛋白收率為65.7％。專利CN 101768206A中保持專利CN1854155的上樣和洗脫工藝不變，去除中間淋洗步驟，得到人血白蛋白純度為92％，收率為71.3％。專利CN101260145也公布采用CaptoMMC分離重組人血白蛋白及其融合蛋白的層析純化工藝，收率和純度均為80％以上。上述基于Capto MMC的專利存在相似問題，純度和收率普遍較低，部分工藝需要高鹽淋洗去除雜質吸附，過程復雜。針對酵母發酵液的特點，提高人血白蛋白的捕獲效率，開發一種高選擇性、具有耐鹽特性、收率高、過程簡單的分離新方法，將有助于簡化人血白蛋白的分離工藝，提高效率，節約成本。

混合模式層析是一種新型的生物分離技術，配基兼有多種功能基團，可以與目標蛋白產生多種相互作用，主要是疏水和靜電相互作用。混合模式介質的配基密度通常較高，吸附容量大，具有耐鹽吸附特性，洗脫條件溫和，特別適合于大規模的分離純化，已在抗體等蛋白的分離純化中得到應用。MX-Trp-650M介質是TOSOH BIOSCIENCE公司開發的混合模式介質，以聚甲基丙烯酸酯微球為基質，色氨酸的氨基通過酰胺鍵偶聯到基質上作為功能配基，配基結構見圖1，主要用于抗體的精制純化，如專利US0264685A1。查閱國內外專利和文獻，未發現MX-Trp-650M及其類似介質用于從酵母發酵液中分離人血白蛋白

本發明利用混合模式層析的優勢，以及人血白蛋白和小分子結合的特殊性，選用以色氨酸為主要功能配基的混合模式介質，直接從酵母發酵液中捕獲人血白蛋白，開發一種混合模式層析分離人血白蛋白的新方法。

發明內容