[發(fā)明專利]從稻種中快速檢測水稻惡苗病病菌的LAMP法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710316754.1
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107022624B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 張傳清;張書亞;李玲;祝倩菲;朱國念
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.用于檢測水稻惡苗病病菌的環(huán)介導等溫擴增方法，利用了用于水稻惡苗病病菌快速檢測方法的LAMP特異性引物組合物，其特征在于：

所述LAMP特異性引物組合物由上下游外引物、上下游內引物這四條引物組成；

上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；

下游外引物(B3)：5’—GCGCCACTATTGCTGTCT—3’；

上游內引物(FIP)：5’—ACTTGCGCTGGAAAGACCAGAACATCCGCCACCTCACTGA—3’；

下游內引物(BIP)：5’—GGTCACCAATCCTCGGCTACAGCCCTAGGAGATGGTCGCTTA—3’；

LAMP反應體系為25μL，為：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿3.0μL、3.75mM羥基萘酚藍1μL、水稻惡苗病病菌DNA模板1μL，雙蒸水補足至25μL；

擴增條件為63℃條件下溫育60min，80℃反應10min。

2.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)介導等溫擴增方法，其特征在于：

利用所述25μL檢測反應體系進行LAMP擴增反應，選擇以下任一方法：

方法一、先在擴增前加入染料羥基萘酚藍作為反應指示劑，以HNB的顏色變化做為結果判定標準，然后進行LAMP擴增反應；反應結束后，顏色發(fā)生變化，即顯色結果觀察到天藍色判斷為陽性，即判定為待測水稻含水稻惡苗病病菌；顏色沒有發(fā)生變化，顯色結果仍為藍紫色判斷為陰性，即判定為待測水稻無水稻惡苗病病菌、或待測水稻所含水稻惡苗病病菌含量未達檢測的最低檢測濃度0.01ng/μL；

方法二、取5～10μL擴增產物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，即判定為待測水稻含水稻惡苗病病菌；如果無擴增條帶則判斷為陰性，即判定為待測水稻無水稻惡苗病病菌，或待測水稻所含水稻惡苗病病菌未達最低檢測濃度10fg/μL。