[發明專利]一種青年豬胰島分離方法及分離用消化液

有效

• 申請號: 201710313206.3
• 申請日: 2017-05-05
• 公開（公告）號: CN107119008B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 王維;馬小倩;王貴強;王佳;李桑;徐暢
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

本發明公開了一種青年豬胰島分離方法及分離用消化液。所述的消化液在使用以基礎培養基或者平衡鹽溶液為液相添加了常規消化酶的基礎上添加了DNase Ⅰ、中性蛋白酶、Ⅰ、Ⅲ型膠原酶、CaCl₂、Trolox、生長抑素等。同時在做胰島分離時改變傳統灌注消化法，變為剪碎組織消化法，以提高青年豬胰島得率。本發明在不影響豬胰島細胞功能的情況下，能夠穩定提高胰島細胞得率、降低經濟成本，并且易于操作，降低污染概率。

技術領域

本發明屬于豬胰島細胞分離的技術領域，具體是涉及一種青年豬胰島分離新方法及分離用消化液。

背景技術

型糖尿病是一種全球性的嚴重威脅人類健康的代謝性疾病，以選擇性免疫介導性破壞胰島β細胞為特點，患者需要外源性胰島素終身治療。但是各種并發癥導致患者生活、經濟負擔加重和死亡率的上升。自Edmonton方案成功后，胰島移植受到了世界的矚目，在總結了全球胰島移植研究成果的基礎上改進了移植的方法和免疫抑制方案，為Ⅰ型糖尿病病人帶來了治愈的希望。同種異體移植的人類胰腺胰島已被證明是一種可行的選擇治療Ⅰ型糖尿病的方法，移植后可改善控制患者血糖，減少胰島素需求，降低低血糖癥的發生。胰島移植目前已經成為Ⅰ型糖尿病患者的有效方法，但是人胰島來源困難，胰島分離技術還不完善，并且存在疾病傳播的風險。最近，豬胰島移植被證實是解決胰島來源短缺的一個可行性方案。

選擇人類胰島移植還是異種移植治療Ⅰ型糖尿病的因素有許多，包括安全性、臨床療效以及胰島的獲得率等。異種胰島移植是近年來應用胰島移植治療胰島素依賴型糖尿病的一個研究熱點，同種移植和干細胞移植有其較多的局限性，而豬胰島素和人胰島素相差一個非保守區氨基酸序列，在人體能夠發揮正常功能，且來源比較豐富，因而被認為是目前適宜的供體來源。青年豬胰腺雖未完全發育成熟，但與新生豬比較，其胰腺體積、重量等都較大，胰島α-Gal抗原表達相對較弱，且胰島成熟度相對較高，因此可獲得大量成熟胰島細胞。但是，青年豬的胰島缺少完整的包膜環繞，分離和純化過程較為復雜，胰島結構和功能完整性極易在此過程中被破壞，從而影響胰島得率和功能。如何高效、成功的分離豬胰島細胞就成為豬胰島移植的制約因素，傳統分離方法存在胰島得率、純度低、可操作性弱或者經濟成本高等問題，從而造成各方面資源的浪費。因此需進一步研究和改進青年豬胰島分離純化技術，以獲得足量結構完整、功能良好的胰島細胞.從而滿足大動物移植實驗和臨床移植的需要。本研究方法旨在探討和改良青年豬胰島分離純化技術。通過剪碎組織消化法以及特別配方的消化液聯合使用，以優化青年豬胰島制備方法，提高胰島得率。

發明內容

本發明的目的是提供一種在不影響胰島功能的情況下，能夠穩定提高胰島得率的青年豬胰島分離方法以及用于分離的消化液，該方法易于操作，降低污染概率。

一種青年豬胰島分離方法，采用剪碎組織的方式進行消化，消化液是在以基礎培養基或者平衡鹽溶液為液相添加了常規消化酶的基礎上加入DNaseⅠ、中性蛋白酶、Ⅰ、Ⅲ型膠原酶、CaCl₂、Trolox、生長抑素。

所述的消化液中加入5～10U/ml DNaseⅠ、12000-4000u/g中性蛋白酶、濃度均為0.1～0.5mg/ml的Ⅰ、Ⅲ型膠原酶、1～10mM CaCl₂、1～10mM Trolox、1～5ug/ml生長抑素；所述的常規消化酶為Ⅴ型膠原酶，添加濃度為0.1～1mg/ml；所述的基礎培養基為RPMI1640，所述的平衡鹽溶液為HBSS。

作為進一步的改進，所述的消化液中Ⅰ、Ⅲ型膠原酶的濃度均為0.5mg/ml，CaCl₂為1mM；Trolox為5mM，生長抑素為2.5ug/ml。

作為進一步的改進，剪碎胰腺組織至組織直徑為1～5mm，加消化液處理。

作為進一步的改進，消化液與胰腺組織的液固比20～50ml/g胰腺。

作為進一步的改進，先粗略剪碎胰腺，用HBSS緩沖液處理，再繼續剪碎后用消化液處理。