[發明專利]一種青年豬胰島分離方法及分離用消化液

有效

• 申請號: 201710313206.3
• 申請日: 2017-05-05
• 公開（公告）號: CN107119008B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 王維;馬小倩;王貴強;王佳;李桑;徐暢
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

1.一種青年豬胰島分離方法，其特征在于，采用剪碎組織的方式進行消化，消化液是在以基礎培養基或者平衡鹽溶液為液相添加了常規消化酶的基礎上加入DNaseⅠ，中性蛋白酶，Ⅰ、Ⅲ型膠原酶，CaCl₂，Trolox，生長抑素；

所述的消化液中加入5~10U/ml DNaseⅠ，4000-12000U/g中性蛋白酶，濃度均為0.1~0.5mg/ml的Ⅰ、Ⅲ型膠原酶，1~10 mM CaCl₂，1~10mM Trolox，1~5ug/ml生長抑素；所述的常規消化酶為Ⅴ型膠原酶，添加濃度為0.1~1mg/ml；所述的基礎培養基為RPMI1640，所述的平衡鹽溶液為HBSS；

具體為以下步驟：

1）將冷缺血時間＜30min的青年豬胰腺沁入碘酒，生理鹽水后轉移到無菌托盤中，托盤保持冰浴；

2）去除胰腺的淋巴和結締組織；

3）將胰腺轉入50ml無菌離心管中稱重并記錄；

4）加10ml緩沖液，剪刀剪碎胰腺組織直徑為3~5mm，取胰腺重量2~5g，加緩沖液至50ml、混勻，200g離心1min，棄上清30~35ml，重復一次；

5）剪碎組織中加25~30ml消化液后繼續剪至組織直徑為1~5mm；

6）將剪碎的組織轉移至250ml錐形瓶中，加消化液至100ml；

7）錐形瓶封口，37℃、100rpm震蕩15~20min，消化液變渾時加中和液至250ml中止消化；所述的中和液為含有5%豬血清的HBSS緩沖液；

8）將40目金屬濾網置于燒杯上，過濾步驟7）制備的組織消化液，并用10ml注射器活塞在金屬濾網上進行研磨，直至濾完所有消化液；

9）中和液清洗2次，200rpm、2min離心，棄上清；

10）冷HBSS重懸，200rpm、2min離心，棄上清，重復2次；

11）加入預冷的成熟培養基重懸沉淀組織，200rpm、2min離心；所述的成熟培養基為含有10%豬血清的RPMI1640培養基；

12）成熟培養基重懸組織細胞，平均分至培養瓶中，37^oC 、5%CO₂培養，每只豬分4~6個T-175的懸浮培養瓶。

2.根據權利要求1所述的青年豬胰島分離方法，其特征在于，所述的消化液中Ⅰ、Ⅲ型膠原酶的濃度均為0.5mg/ml，CaCl₂為1 mM； Trolox為5mM，生長抑素為2.5ug/ml。

3.一種青年豬胰島分離用消化液，其特征在于，消化液是在以基礎培養基或者平衡鹽溶液為液相添加了常規消化酶的基礎上加入DNaseⅠ，中性蛋白酶，Ⅰ、Ⅲ型膠原酶，CaCl₂，Trolox，生長抑素；所述的消化液中加入5~10U/ml DNaseⅠ，4000-12000U/g中性蛋白酶，濃度均為0.1~0.5mg/ml的Ⅰ、Ⅲ型膠原酶，1~10 mM CaCl₂，1 ~10mM Trolox，1~5ug/ml生長抑素；所述的常規消化酶為Ⅴ型膠原酶，添加濃度為0.1~1mg/ml；所述的基礎培養基為RPMI1640，所述的平衡鹽溶液為HBSS。