[發(fā)明專利]一種食品中蛋白質(zhì)定量檢測(cè)用特征肽段的篩選方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710305080.5
• 申請(qǐng)日: 2017-05-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107102149A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任一平;蔣易蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州帕匹德科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司33224
• 代理人: 沈自軍

本發(fā)明公開(kāi)了一種食品中蛋白質(zhì)定量檢測(cè)用特征肽段的篩選方法，屬于蛋白質(zhì)定量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。所述篩選方法包括：(1)利用BLAST比對(duì)分析待測(cè)蛋白質(zhì)理論酶解肽段對(duì)應(yīng)的匹配得分與干擾數(shù)目；(2)經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析目標(biāo)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)值和碎片豐度；(3)利用擬合曲線計(jì)算目標(biāo)肽段在酶解1～3小時(shí)的酶解比率；(4)計(jì)算目標(biāo)肽段的回收率和精密度。本發(fā)明聯(lián)合利用多種方法從特異性、質(zhì)譜特性、酶解特性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性等方面綜合篩選適用于蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量的特征肽段；篩選出的特征肽段可滿足高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)食品基質(zhì)中蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)要求，實(shí)現(xiàn)靈敏度高，精密度好，重現(xiàn)性佳的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)定量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種食品中蛋白質(zhì)定量檢測(cè)用特征肽段的篩選方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量是生物、制藥、食品等研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，其傳統(tǒng)的定量方法主要分為以凱氏定氮法、考馬斯亮蘭法為例的總蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法和以電泳法、酶聯(lián)免疫吸附法為例的單一目標(biāo)蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)是一種新型的蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量技術(shù)，基于基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路，以及傳統(tǒng)電泳法與高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法的技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)組中多種蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)思路主要包括蛋白質(zhì)提取、蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)酶解、同位素標(biāo)記、特征肽段篩選和特征肽段定量檢測(cè)。

如申請(qǐng)公布號(hào)為CN 106442803 A的專利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種可實(shí)現(xiàn)牛血清白蛋白鑒定及絕對(duì)定量的試劑盒及測(cè)定方法，該試劑盒由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和反應(yīng)試劑兩部分組成，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括：特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段；反應(yīng)試劑包括：碳酸氫銨、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、胰蛋白酶、甲酸。通過(guò)將含牛血清白蛋白樣品與反應(yīng)試劑按一定的體積比混合，溫育振蕩后，使之發(fā)生酶解反應(yīng)，再將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和/或最終酶解產(chǎn)物分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，根據(jù)特征肽段母離子和子離子的質(zhì)荷比(m/z)及特征肽段的保留時(shí)間(tR)進(jìn)行定性鑒別，色譜峰面積變化測(cè)算出牛血清白蛋白的絕對(duì)含量。

其中，特征肽段篩選是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的重要步驟。目前，特征肽段的篩選主要通過(guò)肽段的特異性、肽段離子的質(zhì)譜響應(yīng)和肽段離子的碎片豐度進(jìn)行評(píng)價(jià)。Uniport和NCBI等網(wǎng)站能對(duì)肽段進(jìn)行BLAST檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)肽段的特異性；ProteomicsDiscoverer和Skyline等軟件能對(duì)肽段的質(zhì)譜采集文件進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)肽段離子的質(zhì)譜響應(yīng)與碎片豐度。然而，此類方法主要針對(duì)生物樣本中的常見(jiàn)蛋白質(zhì)，當(dāng)用于食品中蛋白質(zhì)特征肽段的篩選時(shí)，存在一定的局限性。

通常食品會(huì)按照一定生產(chǎn)方式進(jìn)行加工處理。比如加熱，食品中的蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，從而會(huì)影響到蛋白質(zhì)的酶解特性；又比如添加基質(zhì)輔料，基質(zhì)輔料也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的酶解效率產(chǎn)生影響。如用于定量的特征肽段無(wú)法酶解完全，其檢測(cè)的結(jié)果偏低，勢(shì)必影響蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。

因此，需要建立一種針對(duì)食品基質(zhì)中蛋白質(zhì)的定量特征肽段的篩選方法，在考慮肽段的特異性、肽段離子的質(zhì)譜響應(yīng)和碎片豐度的同時(shí)，考慮到食品基質(zhì)本身與酶解效率對(duì)定量結(jié)果的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種食品中蛋白質(zhì)定量檢測(cè)用特征肽段的篩選方法，克服現(xiàn)有的篩選方法對(duì)于食品中蛋白質(zhì)定量檢測(cè)存在一定局限性的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案：

一種食品中蛋白質(zhì)定量檢測(cè)用特征肽段的篩選方法，包括：

(1)利用BLAST比對(duì)分析待測(cè)蛋白質(zhì)理論酶解肽段對(duì)應(yīng)的匹配得分與干擾數(shù)目，選擇匹配得分≥20、干擾數(shù)目≤5的理論酶解肽段為候選肽段；

(2)將待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到肽段混合液，經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析所述的候選目標(biāo)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)值和碎片豐度，選擇蛋白質(zhì)組學(xué)軟件評(píng)分為黃色和綠色的候選肽段為候選目標(biāo)肽段；