[發明專利]一種食品中蛋白質定量檢測用特征肽段的篩選方法在審
| 申請號： | 201710305080.5 | 申請日： | 2017-05-03 |
| 公開（公告）號： | CN107102149A | 公開（公告）日： | 2017-08-29 |
| 發明（設計）人： | 任一平;蔣易蓉 | 申請（專利權）人： | 杭州帕匹德科技有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68 |
| 代理公司： | 杭州天勤知識產權代理有限公司33224 | 代理人： | 沈自軍 |
| 地址： | 310026 浙江省杭州市西湖*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 食品 蛋白質 定量 檢測 特征 篩選 方法 | ||
1.一種食品中蛋白質定量檢測用特征肽段的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)利用BLAST比對分析待測蛋白質理論酶解肽段對應的匹配得分與干擾數目，選擇匹配得分≥20、干擾數目≤5的理論酶解肽段為候選肽段；
(2)將待測蛋白質樣品酶解得到肽段混合液，經高效液相色譜串聯質譜分析所述的候選肽段的質譜響應值和碎片豐度，選擇蛋白質組學軟件評分為黃色和綠色的候選肽段為候選目標肽段；
(3)測量待測蛋白質樣品在不同酶解時間對應生成的所述候選目標肽段濃度，將其代入方程擬合得到所述候選目標肽段的酶解曲線方程，根據酶解曲線方程計算在酶解1～3小時對應所述候選目標肽段的酶解比率，選擇酶解比率為100±10％的候選目標肽段為候選特征肽段；
其中，c為對應酶解時間t時目標肽段的濃度；a為初始條件下的蛋白質濃度；a＝A，k＝(1+KM/A)以及m＝vmax/A；
(4)待測蛋白質樣品與加標物混合后得到加標樣，分別測量加標樣酶解生成的所述候選特征肽段濃度，計算所述候選特征肽段的回收率和精密度，回收率＝100±10％和精密度≤10％的候選特征肽段即為所述的特征肽段；
步驟(3)中，方程是由米氏方程推導得出，該方程成立的基本假設為①酶解反應過程中反應速度始終符合米氏方程，即本模型僅適用于符合米氏方程的酶解反應；②酶解反應過程中相較于底物濃度而言，酶過量，即酶解反應速率未達到最大反應速率；③針對同一酶和底物，米氏常數不變；④1mol底物反應生成1mol產物。
2.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，選擇干擾數目為零的理論酶解肽段為候選肽段。
3.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，高效液相色譜串聯質譜分析得到的數據導入Skyline軟件，與蛋白質組學數據庫進行比對。
4.如權利要求3所述的篩選方法，其特征在于，選擇評分為綠色的候選肽段為候選目標肽段。
5.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(3)中，測量≥5個酶解時間對應的候選目標肽段濃度。
6.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)-(4)中，采用胰蛋白酶Trypsin進行酶解。
7.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(3)和(4)中，采用高效液相色譜-質譜聯用的方法測量肽段的濃度。
8.如權利要求7所述的篩選方法，其特征在于，采用二甲基化同位素標記法進行測量。
9.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(4)中，所述加標物采用≥3個濃度水平。
10.如權利要求9所述的篩選方法，其特征在于，加標實驗重復進行3次，每次設置3個平行。
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