[發(fā)明專利]一種酪氨酸酚裂解酶工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710304593.4
• 申請日: 2017-05-03
• 公開（公告）號: CN107325996A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 儲消和;吳黎誠;賴秧秧;程躍;沈建;方明山;生英濤;徐順青
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江綠創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司33214
• 代理人: 馬森火

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種工程菌及其構(gòu)建方法，具體是一種酪氨酸酚裂解酶工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

左旋多巴（3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，簡稱L-DOPA）的化學(xué)名稱為3,4-二羥基苯基丙氨酸，其結(jié)構(gòu)式為：

作為一種重要的生物活性物質(zhì)，L-DOPA是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產(chǎn)物。

上世紀(jì)60年代，國外許多學(xué)者開始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。為了提高L-DOPA產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，研究者們對微生物酶法合成L-DOPA的工藝方法進行了大量研究。

酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，該酶分子量約200kDa，是一個四聚體酶。TPL酶以磷酸吡哆醛（pyridoxal-phosphate，PLP）為輔酶，以鉀離子和氨離子為輔助因子，TPL可以催化L-酪氨酸發(fā)生β-消去反應(yīng)生成苯酚、丙酮酸和氨。由于這個反應(yīng)是可逆的，將鄰苯二酚代替苯酚后，可由鄰苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前體在較高濃度時對酶活都有抑制作用，其中鄰苯二酚及丙酮酸除了有強抑制作用外，還會導(dǎo)致酶的不可逆失活，反應(yīng)條件難以控制，副產(chǎn)物多，L-DOPA的產(chǎn)率低。

印度R. KrishnaveniVandanaRathod等人利用真菌Acremoniumrutilum轉(zhuǎn)化L-酪氨酸至L-多巴，酪氨酸酶比活達1095U/mg。但目前產(chǎn)能較低，只有0.89g/L。

巴基斯坦Ikram-Ul-Haq等人對產(chǎn)酪氨酸酶的Aspergillusoryzae進行紫外誘變，誘變株最大產(chǎn)量達1.28g/L。

埃及Doaa A. R. Mahmoud ? Magda A. El Bendary利用Egyptian halophilic black yeast的酪氨酸酶轉(zhuǎn)化生成L-DOPA，產(chǎn)量為66μg/ml。

韓國研究人員使用酪氨酸酶進行轉(zhuǎn)化時，利用電取代還原試劑，將多巴醌（DOPAquinone）還原為L-多巴，使轉(zhuǎn)化率達95.9，生產(chǎn)強度47.27mg/L*h。

也有一些利用自然界中的細菌，如Escherichia、Proteus（變形菌屬）、Stizolobiumhassjoo和Erwinia(歐文氏菌屬)等，來合成L-DOPA，如左旋多巴酶法合成綜述報道，TPL大腸桿菌基因工程菌轉(zhuǎn)化30h，轉(zhuǎn)化生成29.6g/L的L-DOPA。又如，Jang-Young Lee等人克隆來源于Escherichia coli W(ATCC11105)的對羥基苯乙酸-3-羥基化酶（p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH），轉(zhuǎn)化L-酪氨酸為L-DOPA，產(chǎn)物累積至10g/L。研究者發(fā)現(xiàn)這些重組菌株雖然TPL的表達量高于野生菌株，但最終的L-DOPA合成能力卻沒有明顯提高甚至低于野生菌株。這可能因為要獲得較高的L-DOPA合成能力，菌株除了具備TPL高活性外，還要有相對完善的底物、產(chǎn)物出入細胞膜的轉(zhuǎn)運機制以及對底物鄰苯二酚抑制酶活的耐受力等。總體來說，反應(yīng)條件難以控制，穩(wěn)定性差，副產(chǎn)物多，L-DOPA的產(chǎn)率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種工程菌；鑒定為大腸埃希氏菌，命名為大腸埃希氏菌MBP-TPL（Escherichia coli MBP-TPL），保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢,武漢大學(xué)，保藏日期為2017年4月21日，保藏編號為CCTCC NO：M 2017202。

本發(fā)明的目的是提供所述工程菌的構(gòu)建方法，將酪氨酸酚裂解酶基因與麥芽糖結(jié)合蛋白基因連接在一起構(gòu)建表達質(zhì)粒，即融合表達麥芽糖結(jié)合蛋白和酪氨酸酚裂解酶的表達質(zhì)粒，得到大腸埃希氏菌MBP-TPL。該菌發(fā)酵單位菌體量的酪氨酸酚裂解酶酶活高，可溶性表達量大。

所述工程菌是全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因，連入到含有麥芽糖結(jié)合蛋白基因的表達載體上，構(gòu)建質(zhì)粒pMBP-TPL。

以上操作構(gòu)建的菌提高了單位菌體的酶活，后續(xù)轉(zhuǎn)化合成左旋多巴時，投菌量少，后續(xù)提取速率提高。