[發明專利]一種檢測人類KRAS基因突變的試劑盒

有效

• 申請號: 201710304210.3
• 申請日: 2017-05-03
• 公開（公告）號: CN107354196B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 葛猛;余倩;王宏偉
• 申請（專利權）人: 北京福安華生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了一種檢測人類KRAS基因突變的試劑盒。該試劑盒包括組分甲和/或組分乙；組分甲包括封閉序列甲和引物對甲；組分乙包括封閉序列乙和引物對乙；封閉序列甲和封閉序列乙均為單鏈DNA分子，其中若干核苷酸發生了鎖核酸修飾；引物對甲由上游引物F1和下游引物R1組成；引物對乙由上游引物F2和下游引物R2組成；封閉序列甲、上游引物F1、下游引物R1、封閉序列乙、上游引物F2和下游引物R2的核苷酸序列依次如序列表中的序列2、序列3、序列4、序列6、序列7和序列8所示。實驗表明，采用本發明提供的試劑盒檢測人類KRAS基因突變，準確率高，靈敏度也較高，從而大大的降低了檢測的假陰性率，具有重要的應用價值。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測人類KRAS基因突變的試劑盒。

背景技術

目前，靶向治療已經成為腫瘤臨床治療的重要手段。表皮生長因子受體(EGFR)是靶向治療的主要作用靶點。EGFR靶向藥物包括EGFR單克隆抗體藥西妥昔單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼。EGFR靶向藥物能通過抑制腫瘤發生、發展中必須的表皮生長因子受體酪氨酸激酶阻斷腫瘤細胞的信號傳導，從而達到抑制腫瘤細胞的增生、侵襲、轉移、血管生成并促進腫瘤細胞的凋亡。但是，臨床試驗表明EGFR靶向藥物僅對部分腫瘤患者有顯著的療效。進一步的研究發現，腫瘤組織中KRAS基因發生突變(體細胞突變)的腫瘤患者對EGFR靶向藥物完全耐藥。因此，檢測腫瘤患者KRAS基因是否突變成為決定能否使用EGFR靶向藥物的必要前提條件。

研究表明約30％的人類惡性腫瘤與RAS基因突變有關，RAS基因家族包括KRAS基因、NRAS基因和HRAS基因等，其中KRAS基因突變比例最大，起開關作用，正常時能調控細胞生長通路，異常時則阻止細胞自我毀滅并導致細胞的生長、增殖和血管生成。而且，由于KRAS基因在EGFR下游，KRAS基因變異細胞不受上游EGFR的信號影響，所以對抗EGFR治療效果差。

美國國家癌癥綜合網絡(NCCN)明確指出，KRAS基因是人體腫瘤中常見的致癌基因。KRAS基因的突變常見于多種惡性腫瘤，在肺癌患者中的突變頻率為15-30％，在人結直腸癌患者中的突變頻率為20-50％。導致KRAS基因處于激活狀態的突變部位主要是位于第2外顯子的密碼子12和密碼子13，以及位于第3外顯子的密碼子61。NCCN指出KRAS基因突變會使肺癌患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑產生耐藥，使人結直腸癌患者對抗EGFR抗體類藥物產生耐藥。所以NCCN提出腫瘤患者接受EGFR靶向藥物治療之前，必須進行KRAS基因突變檢測，根據檢測結果決定是否使用EGFR靶藥物作為臨床治療措施。因此KRAS基因突變檢測能提高腫瘤臨床治療的針對性，降低治療費用，節省寶貴的治療時間。檢測KRAS基因突變，對判斷腫瘤的發生發展均有重要意義：良性腫瘤患者若帶有KRAS基因突變，提示有惡變的可能；惡性腫瘤病人若KRAS基因突變陽性，即使病理組織學診斷淋巴結轉移陰性，癌癥復發的可能性也很高。

目前用于基因突變檢測的方法有Sanger測序法、高分辨率溶解曲線檢測法、高效液相色譜法、ARMS-PCR法等。目前比較常用的是ARMS-PCR法，即擴增阻礙突變系統(amplification refractory mutation system ARMS)于1989年建立,該方法靈敏度高，特異性好，但是只可用于對已知突變基因進行檢測。Sanger測序法是突變檢測的金標準，經過了30年的不斷發展與完善，現在已經可以對長達1000bp的DNA片段進行測序，而且對每一個堿基的讀取準確率高達99.999％。由于具有很高的讀取準確率，Sanger測序法成為基因突變、單核苷酸多態性等基因分析的金標準，對未知突變位點也能有效檢出。腫瘤組織中，KRAS野生型細胞與突變型細胞混雜，而Sanger測序法的靈敏度僅為10～20％，即當突變型細胞占整體檢測細胞的10～20％時才能檢出，因此而極大的限制了Sanger測序法的應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何檢測人類KRAS基因是否突變。