[發明專利]真菌人工染色體、組成、方法和用途

有效

• 申請號: 201710302226.0
• 申請日: 2017-05-02
• 公開（公告）號: CN107574178B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 吳成倉
• 申請（專利權）人: 完整基因技術公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/70;C12N15/65;C40B50/06
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 劉明海;周瑞

1.一種真菌人工染色體(FAC)，其包含：

低拷貝數細菌復制起點oriS；

誘導型高拷貝數細菌復制起點oriV；

細菌選擇標記基因；

真菌選擇標記基因；

AMA1真菌自主復制元件；

克隆位點，其包含彼此相鄰、方向相反的一對BstXI位點和位于所述一對BstXI位點側翼、方向相反的兩個I-SceI歸巢限制性位點；

attP位點；

真菌密碼子優化的phi31整合酶基因；和

可操作地連接到整合酶基因的序列為SEQ ID NO：15的真菌誘導型啟動子alcA(p)。

2.一種真菌人工染色體(FAC)，其包含：

低拷貝數細菌復制起點oriS；

誘導型高拷貝數細菌復制起點oriV；

細菌選擇標記基因；

真菌選擇標記基因；

AMA1真菌自主復制元件；

克隆位點，其包含彼此相鄰、方向相反的一對BstXI位點和位于所述一對BstXI位點側翼、方向相反的兩個I-SceI歸巢限制性位點；

相同方向的兩種真菌DNA序列，其中所述兩種真菌DNA序列各自與宿主真菌DNA序列同源，所述兩種真菌DNA序列為SEQ ID NO：12的1,000bp的3'trpC和SEQ ID NO：13的1,007bp的5'-tpC同源序列。

3.根據權利要求1或2所述的真菌人工染色體，其中所述細菌選擇標記基因選自氯霉素抗性基因(camR)、kanR、ampR、genR、tetA、strepR、galK及其組合。

4.根據權利要求1或2所述的真菌人工染色體，其中所述真菌選擇標記基因選自pyrG、ptrA、trpC及其組合。

5.根據權利要求1或2所述的真菌人工染色體，其還包含至少20kb插入物。

6.根據權利要求1或2所述的真菌人工染色體，其還包含至少100kb插入物。

7.根據權利要求1或2所述的真菌人工染色體，其還包含至少一種次生代謝物(SM)基因簇。

8.一種非偏倚FAC文庫構建方法，其包括：

提供來自真菌的高分子量(HMW)基因組DNA；

將所述HMW基因組DNA機械剪切成100kb-300kb長度的片段；

在所述DNA片段上產生平末端；

將BstXI接頭連接到所述平末端，以此產生接頭連接的DNA片段；

通過脈沖場凝膠電泳純化所述接頭連接的DNA片段；以及

將所述純化的接頭連接的DNA片段連接進入BstXI-酶切的、權利要求1-7任一項的真菌人工染色體(FAC)。

9.一種在次生代謝物(SM)基因簇中的靶位點處缺失DNA序列的方法，其包括：

提供權利要求7所述的真菌人工染色體(FAC)；

提供缺失DNA，其包括a)與靶DNA序列第一側的側翼序列同源的第一序列，b)與靶DNA序列第二側的側翼序列同源的第二序列，和c)細菌選擇標記；

轉化真菌人工染色體并將DNA插入表達Red/ET重組酶的大腸桿菌菌株；和

選擇包含細菌選擇標記的轉化的大腸桿菌細胞。

10.一種將DNA序列插入次生代謝物(SM)基因簇中的靶位點的方法，其包括：

提供權利要求7所述的真菌人工染色體(FAC)；

提供插入DNA，其包括a)與靶位點第一側的側翼序列同源的第一序列，b)待插入序列，c)與靶位點第二側的側翼序列同源的第二序列，和d)細菌選擇標記；

轉化FAC并將DNA插入表達Red/ET重組酶的大腸桿菌菌株；和

選擇包含細菌選擇標記的轉化的大腸桿菌細胞。