[發明專利]一種快速篩選、鑒定及定量發酵食品中耐酸乳桿菌的方法

有效

• 申請號: 201710285328.6
• 申請日: 2017-04-27
• 公開（公告）號: CN106906302B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 徐巖;吳群;王石壘
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/225
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種快速篩選、鑒定及定量發酵食品中耐酸乳桿菌的方法，屬于生物技術及發酵食品領域。本發明針對耐酸乳桿菌的特異性，設計出耐酸乳桿菌的特異性引物，通過改良MRS選擇性培養基分離發酵食品中的乳酸菌，利用特異性引物以及菌落聚合酶鏈式反應(PCR)能夠快速準確地鑒定出目的菌株。該引物對適用于傳統發酵食品中耐酸乳桿菌的篩選、鑒定及定量。

技術領域

本發明涉及一種快速篩選、鑒定及定量發酵食品中耐酸乳桿菌的方法，屬于生物技術及發酵食品領域。

背景技術

耐酸乳桿菌廣泛存在于各種發酵食品釀造體系中，包括白酒、黃酒、食醋、泡菜、醬油、酸奶、干酪、酒釀、豆豉、乳腐、黃酒、啤酒、葡萄酒等，并且是發酵食品釀造體系中的優勢微生物。通過高通量測序結果表明，在白酒酒醅發酵中后期細菌中有90％以上為耐酸乳桿菌，其優勢階段占據整個發酵階段2/3的時間，這是由于耐酸乳桿菌能夠耐受或適應于高酸度、高乙醇濃度、低含氧量等不利條件的特性所決定的。有研究發現，白酒發酵中后期是乙酸、乳酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯等重要風味物質形成的階段，而耐酸乳桿菌被認為是生成這些風味物質的重要菌株，因此該菌對白酒的風味具有巨大的貢獻。故而對于耐酸乳桿菌的分離鑒定非常重要。但是耐酸乳桿菌為兼性厭氧微生物，營養條件十分苛刻，且耐酸乳桿菌在菌落形態與理化性質上與多數乳酸菌間差異不顯著，這給耐酸乳桿菌的篩選、鑒定及定量工作帶來了極大的困難，也是目前對于耐酸乳桿菌研究較少的主要原因。

由于常規培養基缺乏耐酸乳桿菌菌生長所需的獨特生長因子，耐酸乳桿菌在常規MRS、番茄汁瓊脂(TJA)等培養基上幾乎不能生長；此外，目前對于耐酸乳桿菌的篩選鑒定，主要通過菌株的理化性質或16srDNA的方法。這種鑒定方法存在周期長、費用高、成功率低等問題。因此，在耐酸乳桿菌篩選鑒定方面存在很多亟待解決的問題，建立一種快速篩選、鑒定及定量發酵食品中耐酸乳桿菌的方法是十分必要并且具有重要意義的。

發明內容

為解決上述問題，彌補現有乳酸菌篩選、鑒定及定量技術的不足，首先，本發明提供了一種有效提高乳酸菌篩選、鑒定及定量效率的特異性引物。其次，本發明改良了傳統的MRS培養，添加多種營養因子提高了乳酸菌的存活率，添加制霉素抑制雜菌的生長，添加溴甲酚綠能快速識別產酸乳酸菌。最后，利用特異性引物能夠快速、準確地從產酸乳酸菌中篩選出耐酸乳桿菌。

本發明的第一個內容是提供了一種發酵食品中耐酸乳桿菌的篩選、鑒定及其特異性定量方法，所述方法是以上述耐酸乳桿菌中糖基水解酶的編碼基因的核苷酸序列作為模板設計引物對。

在本發明的一種實施方式中，所述糖基水解酶編碼基因的核苷酸序列為SEQIDNO.1。

本發明的第二個內容是提供了一對特異性引物，以提高耐酸乳桿菌的篩選、鑒定及定量效率，所述特異性引物對序列為LaF1:5′-AACATCCCCAGAGCGTCAAG-3′；LaR1:5′-GGCACTACCCCAAGCATCTT-3′。

本發明的第三個內容是該特異性引物對在耐酸乳桿菌篩選鑒定方面的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述樣品為任意來源含有耐酸乳桿菌的菌體、菌落、菌液以及基因組樣品。

在本發明的一種實施方式中，所述篩選是在每升MRS培養基主溶液的基礎上，添加1～5mL副溶液混勻使用；副溶液的組成：指示劑溴甲酚綠0.01～0.02g/mL，營養因子D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽、甲瓦龍酸內脂和維生素B11，其中，D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽0.01～0.02g/mL、甲瓦龍酸內脂0.005～0.015g/mL、維生素B11 0.01～0.015g/mL，制霉素0.04～0.06g/mL，溶劑為二甲基亞砜，使用無菌濾膜過濾滅菌。