[發(fā)明專利]一種基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710284532.6
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN106918584B
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳春來;王文娟;彭思佳
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京鴻元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11327
• 代理人: 邸更巖

一種基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法，屬于生物大分子成像技術(shù)領(lǐng)域。該方法利用光激活熒光染料對生物樣品進行標(biāo)記作為供體，用波長為200?450納米的激活光源使得光激活的熒光染料發(fā)生順反異構(gòu)、電子傳遞或者化學(xué)鍵斷裂等化學(xué)反應(yīng)，使之從不發(fā)射熒光狀態(tài)(非激活態(tài))轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)射熒光狀態(tài)(激活態(tài))；此時利用波長為450?1200納米的激發(fā)光源可激發(fā)其發(fā)射熒光。當(dāng)供體與非光激活的熒光染料標(biāo)記的受體的距離在1?10納米之間時，供體的能量就會轉(zhuǎn)移給受體，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。本方法的優(yōu)點是突破熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)中的熒光樣品濃度的障礙(50nM左右)，從而實現(xiàn)在接近生理條件的微摩爾濃度下進行單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的測量。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物大分子成像領(lǐng)域，更具體地，涉及一種突破現(xiàn)有全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)中的熒光濃度屏障的新型成像技術(shù)和方法。

背景技術(shù)：

單分子熒光技術(shù)可以在復(fù)雜體系內(nèi)實時觀測生物分子的動態(tài)過程，并揭示隱藏在傳統(tǒng)系綜平均測量中的重要信息，包括生物分子之間的差異性以及反應(yīng)過程中的瞬時中間態(tài)等。單分子熒光手段的以上優(yōu)點使得它近年得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，其快速發(fā)展使得很多傳統(tǒng)的生物學(xué)問題得以用新實驗技術(shù)來解決(Sasmal D.K.et al.,Nanoscale,2016,8,19928-19944)。

運用最為廣泛的單分子技術(shù)之一是基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)：單個熒光供體和受體形成的FRET對被激光激活并檢測其發(fā)出的熒光強度，供體和受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率的變化可以表征FRET配對標(biāo)記位點之間相對距離的變化，從而反映分子構(gòu)型的實時動態(tài)變化(Roy R.et al.,NatureMethods,2008,5,507-516)。單分子FRET已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究生物大分子的自身構(gòu)型變化和分子間相互作用等動態(tài)過程。

然而，基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡的單分子FRET技術(shù)仍然存在著缺陷和不足(Juette M.F.et al.,Current opinion in chemical biology,2014,20,103-111)。全內(nèi)反射熒光顯微鏡中最高可使用的熒光標(biāo)記樣品濃度——既熒光濃度屏障——在50nM左右，這遠遠低于許多生化反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)，也遠低于許多生物分子在生理條件下的濃度(μM量級)。因此，很多利用單分子FRET開展的研究是在遠低于生理濃度的條件下進行的，其結(jié)論是否能真實反應(yīng)生理條件還有待驗證。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是突破全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)中的熒光濃度屏障(50nM)，實現(xiàn)在接近生理條件的μM以上濃度下進行單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的測量。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于該方法按如下步驟進行：

1)將光激活的熒光染料和非光激活熒光染料分別溶解在有機溶劑中，染料終濃度為1-50mM；

2)生物樣品的摩爾濃度為10-200μM，生物樣品濃度和熒光染料濃度的比例為1：1-10；生物樣品和熒光染料在4-37℃下反應(yīng)0.5-24小時,所述的生物樣品為核酸或者蛋白；

3)將步驟2)反應(yīng)后的溶液加入脫鹽柱中，用緩沖液洗脫得到標(biāo)記的熒光染料的樣品，從而去除多余的沒有標(biāo)記的生物樣品的染料；

4)用光激活熒光染料標(biāo)記生物樣品為供體，用非光激活熒光染料標(biāo)記生物樣品作為受體；將非光激活染料標(biāo)記的生物樣品固定在玻片上，之后加入濃度為納摩爾到微摩爾量級的光激活染料標(biāo)記的生物樣品，在全內(nèi)反射熒光顯微鏡下進行成像；打開激活光源(6)，用波長為200-450納米的激光激活供體，使玻片表面附近的熒光染料都轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)射熒光的激活態(tài)；

5)關(guān)閉激活光源，打開另一波長為450-1200納米的激發(fā)光源(7)，與表面的生物樣品結(jié)合的激活態(tài)熒光標(biāo)記分子會被激發(fā)產(chǎn)生熒光；