[發(fā)明專利]遼東櫟的SSR分子標(biāo)記引物和鑒定遼東櫟品種的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710274358.7
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN107419003A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭斌;楊欣超;王建義;馬佳琳
• 申請（專利權(quán)）人: 山西省林業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11498
• 代理人: 王加嶺,楊靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種遼東櫟的SSR分子標(biāo)記引物和鑒定遼東櫟品種的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

遼東櫟(Quercus liaotungensis Koidz)是殼斗科櫟屬的植物，落葉喬木，高達(dá)15m；喜光、耐干旱瘠薄和萌芽力強，多次砍伐仍能萌生成林；木材堅硬耐腐，可供建筑、枕木、家具等使用。目前，遼東櫟在山西已被廣泛應(yīng)用于荒山造林，因此，選取優(yōu)良品種的遼東櫟進(jìn)行育苗具有重要的意義。山西省林業(yè)科學(xué)院經(jīng)過多年努力，選育了表現(xiàn)優(yōu)良的6個品種的遼東櫟，但根據(jù)外觀形態(tài)很難區(qū)分不同品種的遼東櫟。本申請?zhí)岢隼肧SR分子標(biāo)記來區(qū)分不同品種的遼東櫟的方法，其結(jié)果具有鑒別準(zhǔn)確、高效和可靠。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種遼東櫟的SSR分子標(biāo)記引物和利用該SSR分子標(biāo)記引物鑒定遼東櫟品種的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種遼東櫟的SSR分子標(biāo)記引物，所述引物包括ssrQrZAG 96、ssrQrZAG 7、Qden 03011及Qden 05031，各引物所對應(yīng)的序列為：

ssrQrZAG 96正向：ACATCATCAACTATGCCGAACA

反向：GGTTGGGAAAAGGAGATCAGA；

ssrQrZAG 7正向：CAACTTGGTGTTCGGATCAA

反向：GTGCATTTCTTTTATAGCATTCAC；

Qden 03011正向：AACCC AACCTTCCCTTCATC

反向：GCAGTGGTGCCTAATGTAGAC；

Qden 05031正向：CCCCGATTCGCCATCATTGT

反向：GTAACGCCGTTTTTCTCCACC。

優(yōu)選地，所述引物的退火溫度都為58℃。

本發(fā)明還提供了一種利用SSR分子標(biāo)記引物鑒定遼東櫟品種的方法，該方法包括以下步驟：

提取供試遼東櫟品種樣品的DNA；

利用所述的SSR分子標(biāo)記引物對遼東櫟品種樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20μL，擴(kuò)增反應(yīng)體系為：LA TaqDNA Polymerase(5U/μL)0.2μL、10×PCR mix 2.0μL、反向引物(10pmol/μL)0.4μL、正向引物(10pmol/μL)0.2μL、M13+正向引物0.2μL、DNA模板(<1μg)1.0μL和ddH2O 16.0；熱循環(huán)條件如下：反應(yīng)先在94℃預(yù)變性5min,然后在94℃變性20s、58℃復(fù)性20s、72℃延伸20s條件下進(jìn)行30輪循環(huán)，最后在72℃延伸5min，4℃保存；

將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。

優(yōu)選地，通過4對SSR分子標(biāo)記引物PCR擴(kuò)增后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，對供試遼東櫟品種與已知遼東櫟品種進(jìn)行鑒定。

施用本發(fā)明提供的鑒定遼東櫟品種的方法后，能夠準(zhǔn)確、高效和可靠鑒別不同品種的遼東櫟。

附圖說明

圖1為6個遼東櫟品種基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖(M,DL2000marker；A-F分別表示6個品種遼東櫟基因組DNA)；

圖2為6個遼東櫟品種ssrQrZAG 96等位基因毛細(xì)管電泳圖譜(A-F依次代表6供試樣本)；

圖3為6個遼東櫟品種Qden 05011等位基因毛細(xì)管電泳圖譜(A-F依次代表6供試樣本)；

圖4為6個遼東櫟品種Qden 05031等位基因毛細(xì)管電泳圖譜(A-F依次代表6供試樣本)；

圖5為6個遼東櫟品種ssrQrZAG 7等位基因毛細(xì)管電泳圖譜(A-F依次代表6供試樣本)。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

1、材料

6個品種遼東櫟品種分別編號為A、B、C、D、E和F，由山西省林科院提供，待試樣本葉片液氮速凍處理，保存在-76℃冰箱備用。熒光標(biāo)記SSR引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息如下表1：

表1.用于不同品種遼東櫟SSR分析的PCR引物

2、方法

2.1基因組DNA的提取