[發明專利]一種構建穩定過表達CXCR4的iPSCs的方法及其應用

有效

• 申請號: 201710272057.0
• 申請日: 2017-04-24
• 公開（公告）號: CN107236711B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 郭軍;江燦
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗;陳燕嫻

1.一種構建穩定過表達CXCR4的iPSCs的方法，其特征在于包括如下步驟：

利用TALEN技術誘導CXCR4基因啟動子區域去甲基化，通過CXCR4慢病毒顆粒轉染iPSCs，得到穩定過表達CXCR4的iPSCs，從而實現靶向基因的過表達；

具體包括如下步驟：

1)CXCR4基因的啟動子區富含CpG甲基化位點，合成了能夠識別并定位CXCR4基因啟動子區DNA序列的TALE基因，這個人工合成基因定位CXCR4b：5′-TTCAATTTTGTTGCCTGGTGCA-3′；

2)然后將所述人工合成基因同DNA去甲基化酶Tet1的催化域融合，并在Tet1c的末端用T2A技術連接綠色熒光蛋白GFP，得到融合基因CXCR4b-Tet1c-GFP；最后將這個融合基因克隆到慢病毒質粒pCDH CD527A，得到載體質粒CXCR4b-Tet1c-GFP；

3)慢病毒的包裝和濃縮：將慢病毒包裝質粒和載體質粒CXCR4b-Tet1c-GFP以1：1的摩爾比例混合，在Lipofectamine2000的作用下共轉染293FT細胞，置于37℃、體積分數5％CO₂的培養箱中培養；12h后換液，加入新鮮293FT細胞培養液；72h后觀察有強綠色熒光及細胞融合現象時收集培養上清，4℃、4500r/min離心15min，將病毒上清液用0.45μm濾膜過濾以去除細胞碎片，4℃、50000×g高速離心90min；用RNase-freeL-DMEM懸浮病毒顆粒沉淀，-80℃凍存備用；同法構建只含綠色熒光蛋白的空病毒；

4)CXCR4b-Tet1c-GFP病毒顆粒穩定感染iPSCs：將對數生長期iPSCs消化并離心后，以分化培養基重懸成濃度1×10⁶/L細胞懸液，將病毒CXCR4b-Tet1c-GFP和空病毒以10:1轉染誘導性多能干細胞；每天更換1次培養基；病毒感染24～48h后，更換新鮮培養液；并同時使用氨芐青霉素進行篩選；得到穩定過表達CXCR4的iPSCs。

2.一種穩定過表達CXCR4的iPSCs，其特征在于通過權利要求1所述的方法構建得到。

3.權利要求2所述的穩定過表達CXCR4的iPSCs在體外增強細胞遷移特性中的應用。