[發明專利]高催化效率的纖維素酶突變體及其基因和應用

有效

• 申請號: 201710269927.9
• 申請日: 2017-04-24
• 公開（公告）號: CN107022536B
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 姚斌;羅會穎;鄭菲;涂濤;蘇小運;黃火清;王苑;柏映國;王亞茹;孟昆
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京法信智言知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11737
• 代理人: 劉靜榮

本發明涉及基因工程領域，具體涉及高催化效率的纖維素酶突變體及其基因和應用。所述纖維素酶突變體的氨基酸序列為氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纖維素酶GtCel5的第233位天冬酰胺突變為丙氨酸或甘氨酸。纖維素酶突變體比活性比野生型的催化效率及比活性有顯著提高，為其在工業生產領域提供了基礎。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及高催化效率的纖維素酶突變體及其基因和應用。

背景技術

纖維素酶是將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖的一組復雜酶系的總稱，又稱纖維素酶系,根據其中各酶功能的差異，主要被分為3大類：內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。纖維素酶已被廣泛應用于食品、醫藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開采、精細化工及生物技術等諸多領域，是一種新型的工業酶，具有很大的潛在應用價值。

不同的微生物產生的纖維素酶，其結構和功能差異較大，自然界中存在的纖維素資源來源復雜，其結構和功能差異較大，不同來源的纖維素酶對它們的降解效果也不盡相同，針對不同來源的纖維素尋找降解效果較高的纖維素酶，是當前纖維素酶領域的熱點之一。雖然許多纖維素酶被克隆分離及性質測定，但這些酶的性質特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范圍不合適，熱穩定性差，表達量低等，均不能滿足實際應用的需要。因此人們希望能夠找到新的能夠滿足實際應用需求的纖維素酶，從而能夠進一步推廣纖維素酶在飼料、食品、醫藥等行業中應用。

高比活、高催化效率的纖維素酶工程菌株的獲得主要通過誘變、篩選和酶分子改良獲得。誘變分為自然突變和人工誘變，自然突變成功的幾率非常小，人工誘變的工作量較大且有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質難以控制。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。

發明內容

本發明提供了一種高催化效率纖維素酶突變體，將來源于Gloeophyllum trabeumCBS 900.73五家族的低催化效率纖維素酶GtCel5第233位點進行定點突變。

本發明的再一目的是提供包含上述維素酶突變體基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述維素酶突變體基因的重組菌株。

根據本發明的具體實施方式，所述纖維素酶突變體的氨基酸序列為氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纖維素酶GtCel5的第233位天冬酰胺突變為丙氨酸或甘氨酸

野生型低催化效率的纖維素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

高催化效率的纖維素酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

所述野生型低催化效率纖維素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述高催化效率纖維素酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述高催化效率纖維素酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根據本發明的具體實施方式，制備所述高催化效率纖維素酶突變體的方法包括以下步驟：

1)采用over-lap PCR的方法擴增高催化效率纖維素酶酶突變體序列片段；

2)將催化效率纖維素酶突變體序列片段克隆到表達載體pPIC 9r上，重組載體命名pPIC9r-Gtcel5-N233A,pPIC9r-Gtcel5-N233G；

3)將突變體重組載體轉化畢赤酵母GS115，誘導表達，獲得突變株，優選為GS115/Gtcel5-N233A,GS115/Gtcel5-N233G；