[發(fā)明專利]IL?2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系及其制備方法和應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710268102.5 | 申請日： | 2017-04-22 |
| 公開（公告）號： | CN106929529A | 公開（公告）日： | 2017-07-07 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 郭宇;匡銘;彭穗;王晶;趙坤;彭振偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 中山大學附屬第一醫(yī)院 |
| 主分類號： | C12N15/79 | 分類號： | C12N15/79;C12N15/66;C12N15/23;C12N15/26;A61K48/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 佛山幫專知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)44387 | 代理人： | 胡麗琴 |
| 地址： | 510000 *** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | il ifn 蛋白 表達 體系 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系，其中，所述真核表達體系同時包含IL-2基因的核苷酸序列和IFNγ基因的核苷酸序列，所述IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述IFNγ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.一種IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系，其中，所述真核表達體系含有IL-2和IFNγ蛋白的編碼基因，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一種IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系的制備方法，包括以下步驟：
(1)以化學合成的寡核苷酸單鏈混合物為靶標基因，設(shè)計特異性引物如下：
上游引物：GACACGCTAGCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTG(SEQ ID NO.2)
下游引物：GACACGGATCCTTACTGGGATGCTCTTCGACC(SEQ ID NO.3)
在含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通過PCR反應(yīng)進行擴增，獲得第一輪PCR產(chǎn)物；
以第一輪PCR反應(yīng)液為模板，在上述含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，進行第二次擴增；進行電泳回收基因片段；
(2)將步驟(1)電泳所得基因片段在限制性內(nèi)切酶Nhe I和BamH I存在下進行雙酶切，得到酶切的基因片段，大小為987bp，序列如SEQ ID NO:1所示；
(3)載體pIRES2-EGFP在限制性內(nèi)切酶Nhe I和BamH I存在下進行雙酶切，得到酶切的載體片段，序列如SEQ ID NO:6所示；
(4)連接基因片段和載體片段，構(gòu)建得到pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表達體系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系的制備方法，其中，所述步驟(1)中第一輪PCR反應(yīng)體系為：寡核苷酸單鏈混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP 1ul 25mmol/L；10×pfu Buffer 5ul；pfu聚合酶0.4ul 5u/ul；ddH2O補足至50ul；
第一輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反應(yīng)循環(huán)22次；72℃6min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系的制備方法，其中，所述步驟(1)中第二輪PCR反應(yīng)體系為：第一輪PCR產(chǎn)物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP 1ul 25mmol/L；10×pfu Buffer 5ul 5u/ul；pfu聚合酶0.4ul；ddH2O補足至41ul；
第二輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反應(yīng)循環(huán)22次；72℃6min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系的制備方法，其中，所述步驟(2)中雙酶切的酶切條件為：步驟(1)所得基因片段20ul；限制性內(nèi)切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 5ul；ddH2O補足至50ul；酶切反應(yīng)體系在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系的制備方法，其中，所述步驟(3)中雙酶切的酶切條件為：pIRES2-EGFP 1.5ug；限制性內(nèi)切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 10ul；ddH2O補足至50ul；酶切反應(yīng)體系在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系的制備方法，其中，所述步驟(4)中連接反應(yīng)條件為：酶切的基因片段6ul；酶切的載體片段，5ul；10×T4 DNA ligase Buffer 2ul；T4 DNA ligase 1ul，5u/ul；ddH2O補足至20ul；連接混合液于16℃水浴連接2h。
9.含有權(quán)利要求3～8任一方法制備的IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系的重組菌。
10.權(quán)利要求3～8任一方法制備的IL-2和IFNγ蛋白共表達的真核表達體系在免疫治療中的用途。
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