[發明專利]一種檢測甲氨蝶呤的ELISA試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710266817.7
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107219357A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 方勇飛;牟方祥;吳紅;陳思;閆彩霞;陳欣
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司11570
• 代理人: 劉杰

本發明的提供了一種檢測甲氨蝶呤的ELISA試劑盒及其應用，所述試劑盒包括如下試劑：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤單克隆抗體，抗體稀釋液，HRP標記羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤標準品，洗液濃縮液，樣本稀釋液，TMB顯色液以及終止液。本發明通過各試劑的組合及對試劑參數的改進，得到一種穩定、快速、簡便的甲氨蝶呤檢測試劑盒，且應用時所述試劑盒標準偏差值較小。能同時用于大劑量甲氨蝶呤使用患者的血藥濃度檢測以及小劑量甲氨蝶呤治療量患者血清中藥物濃度檢測。

技術領域

本發明屬于免疫檢測領域，具體涉及一種檢測甲氨蝶呤的ELISA試劑盒及其應用。

背景技術

甲氨蝶呤(MTX)是用于治療癌癥和自身免疫疾病的藥物。它被設計為抗葉酸鹽以抑制葉酸的代謝。在癌癥治療中，甲氨蝶呤通過阻斷葉酸結合競爭性抑制二氫葉酸還原酶(DHFR)，DHFR將二氫葉酸轉化為活性四氫葉酸。DHFR的抑制導致抑制嘌呤和嘧啶堿基的合成，有效限制DNA和RNA合成和癌細胞生長。在自身免疫疾病中，特別是在類風濕性關節炎的治療中，甲氨蝶呤似乎影響幾種通路，導致T細胞活化的抑制。這些作用包括抑制細胞間粘附分子的T細胞表達，抑制甲基轉移酶活性和增加CD95敏感性，導致活性T細胞凋亡。

監測甲氨蝶呤水平對于確保在治療或治療期間適當水平是重要的。高水平的甲氨蝶呤可以導致毒性和潛在的腎衰竭以及免疫抑制。此外，甲氨蝶呤已知與各種各樣的藥物相互作用，導致額外的并發癥。確定來自受試者的樣品中甲氨蝶呤的存在可以幫助解釋研究結果。甲氨蝶呤被建立為類風濕關節炎的最有效和安全的治療之一。安全性分析確保甲氨蝶呤將繼續在新研究中與其他新藥或既成藥物聯合使用。在其用作癌癥治療劑時也是如此。

大劑量的MTX常用于腫瘤、白血病的治療，最新的兒童急性淋巴性白血病診療方案提出甲氨蝶呤使用劑量為2～5g/(m2.24h)，患者血清濃度可高達20μmol/L，常用檢測方法主要有高效液相色譜法、熒光偏振免疫法、酶放大免疫法。近年來MTX用于類風濕關節炎、干燥綜合征、銀屑病關節炎等系統性自身免疫性疾病的治療，常用劑量為5～20mg/周，患者服藥后24h內血清MTX濃度最高為20nmol/L，兩者濃度相差了近1000倍。傳統的檢測方法很難檢出，現常用高效液相色譜質譜法檢測。但色譜質譜法樣本前處理較復雜，操作步驟也相對繁瑣，且色譜質譜儀造價昂貴，檢測成本高，不適合與大樣本檢測及基層開展。

發明內容

針對現有技術中的上述缺陷，本發明的主要目的在于提供一種檢測甲氨蝶呤的ELISA試劑盒及其應用，所述試劑盒能快速、簡便、穩定的檢測樣本中的甲氨蝶呤，且標準偏差值較小。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案:一種檢測甲氨蝶呤的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括如下試劑：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤單克隆抗體，抗體稀釋液，HRP標記羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤標準品，洗液濃縮液，樣本稀釋液，TMB顯色液以及終止液。

作為進一步的優選，所述包被甲氨蝶呤的96孔微孔板的制備方法包括如下步驟：

采用包被緩沖液將包被原稀釋，將稀釋后的所述包被原加入至微孔中，以封板膜貼封，包被過夜或恒溫箱中包被溫育2-4h；

所述包被過夜或溫育后，甩掉板中液體后拍干，洗板，拍干，每孔加入封閉液，以封板膜貼封，于恒溫箱中溫育1-3h封閉；

所述封閉后，取板拍干，加入浸板液，于恒溫箱中溫育1-3h浸板；

所述浸板后，取板拍干，將板抽真空。

作為進一步的優選，所述包被原包括甲氨蝶呤-雞蛋清白蛋白。

作為進一步的優選，所述包被緩沖液包括CB緩沖液；所述洗板的洗液包括1×TBST溶液，所述封閉液包括10×PBS溶液、牛血清以及牛血清白蛋白，所述浸板液包括10×PBS溶液、蔗糖及海藻糖。