[發明專利]一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株及制備方法、應用

在審

• 申請號: 201710266003.3
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107227300A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 方勇飛;牟方祥;吳紅;陳思;閆彩霞;陳欣
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院;武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C12R1/91
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司11570
• 代理人: 劉杰

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株及制備方法、應用。

背景技術

甲氨蝶呤(MTX)是一種抗惡性腫瘤藥、抗風濕藥，屬于葉酸代謝拮抗劑。作為抗癌劑，它用于治療白血病和滋養細胞疾病。但是，它有抑制骨髓功能、導致肝腎功能障礙的嚴重副作用，必須在用藥過程中進行多次臨床檢查，仔細觀察患者的狀態。通常，在使用MTX后應用四氫葉酸鈣(CF)進行解救從而減輕MTX不良反應，但仍然有不同程度的毒性反應，甚至有致死的危險。如何保證臨床上既要大劑量治療腫瘤而又不致產生嚴重的毒副反應就是監測MTX血藥濃度。

MTX測定的方法包括微生物學，熒光分光光度法和分光光度法酶抑制方法以及競爭性蛋白結合測定，放射性和酶免疫測定。在甲氨蝶呤的血藥濃度測定方法中，59.09％采用高效液相色譜法，34.09％采用熒光偏振免疫分析法，其它方法僅占6.82％。由于這些方法對于MTX和結構相關分子存在缺乏選擇性，目前已經開發了同時測量藥物及其代謝物的高效液相色譜(HPLC)技術。盡管有這個優點，仍然需要可以在臨床實驗室中常規進行的MTX高靈敏的免疫測定方法。目前，只有MTX的血藥濃度監測才能滿足治療的個體化，增加療效，減少毒副作用，降低藥動學差異，增加患者依從性。將近1/3的醫院和研究機構必須尋找新的甲氨蝶呤血藥濃度檢測方法。而現有的抗體用于測定測試樣品中甲氨蝶呤的存在或量的免疫測定時，由于特異性差而檢測效果較差，常出現錯誤的測定結果。

發明內容

針對現有技術中的上述缺陷，本發明的主要目的在于提供一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株及制備方法、應用，所述雜交瘤細胞株能產生抗甲氨蝶呤單克隆抗體，所述抗體具有高度特異性，用于特異性識別甲氨蝶呤。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株生物保藏編號為CCTCC NO:C201726。

一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，所述方法包括如下步驟：

用抗原MTX-BSA(牛血清白蛋白)免疫Balb/c小鼠；

收集免疫小鼠的脾細胞，并與Sp2/0骨髓瘤細胞進行融合，融合的雜交瘤細胞用HAT培養基進行選擇性培養；

采用間接競爭ELISA方法對雜交瘤細胞培養上清中的抗體含量進行檢測，篩選獲得穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

作為進一步的優選，所述免疫包括：所述小鼠為6-8周齡雌性Balb/c小鼠，將純化的MTX-BSA蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化，然后采用弗氏不完全佐劑乳化抗原，充分混合至油包水狀態進行皮下多點免疫，2-3次加強免疫。

作為進一步的優選，所述融合包括：無菌條件下取小鼠脾臟制成細胞懸液，在PEG1450介導下，融合小鼠骨髓瘤SP2/0細胞與脾細胞，融合后加入DMEM培養基終止。

作為進一步的優選，所述小鼠骨髓瘤SP2/0細胞與脾細胞的個數比為1:5。

作為進一步的優選，所述檢測包括：液體和半固體融合板檢測。

作為進一步的優選，所述液體融合板檢測包括：待融合板換液細胞長至中等大小約1萬個細胞以上開始檢測，在競爭法ELISA質控合格后挑選陽性孔作亞克隆。

作為進一步的優選，所述半固體融合板檢測包括：常規細胞融合后，用甲基纖維素半固體培養基重懸細胞沉淀，重懸于20ml 2％甲基纖維素濃度的半固體培養基，于細胞培養皿中培養；7-10天后觀察培養皿中細胞克隆的大小以及數量，在體式顯微鏡下挑出至20％胎牛血清的HT培養基中培養2-3天后進行效價檢測，在競爭法ELISA質控合格作亞克隆。

作為進一步的優選，所述甲基纖維素半固體培養基包括：DMEM、MEM、2％質量百分比的甲基纖維素、胎牛血清、50×HAT以及L－谷氨酰胺。

一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的應用，所述雜交瘤細胞株用于制備抗甲氨蝶呤單克隆抗體，所述單克隆抗體可用于特異性識別甲氨蝶呤。

作為進一步的優選，所述抗甲氨蝶呤單克隆抗體的制備方法包括如下步驟:將所述雜交瘤細胞注射預先用弗氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集所述小鼠的腹水，所述腹水經過預處理后純化。

作為進一步的優選，所述純化包括：選用Protein G-瓊脂糖親和層析柱純化。

本發明的有益效果是：