[發明專利]一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株及制備方法、應用

在審

• 申請號: 201710266003.3
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107227300A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 方勇飛;牟方祥;吳紅;陳思;閆彩霞;陳欣
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院;武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C12R1/91
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司11570
• 代理人: 劉杰

1.一種分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株，其特征在于：所述雜交瘤細胞株生物保藏編號為CCTCC NO:C201726。

2.如權利要求1所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

用抗原MTX-BSA免疫Balb/c小鼠；

收集免疫小鼠的脾細胞，并與Sp2/0骨髓瘤細胞進行融合，融合的雜交瘤細胞用HAT培養基進行選擇性培養；

采用間接競爭ELISA方法對雜交瘤細胞培養上清中的抗體含量進行檢測，篩選獲得穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

3.根據權利要求2所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述免疫包括：所述小鼠為6-8周齡雌性Balb/c小鼠，將純化的MTX-BSA蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化，然后采用弗氏不完全佐劑乳化抗原，充分混合至油包水狀態進行皮下多點免疫，2-3次加強免疫。

4.根據權利要求2所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述融合包括：無菌條件下取小鼠脾臟制成細胞懸液，在PEG1450介導下，融合小鼠骨髓瘤SP2/0細胞與脾細胞，融合后加入DMEM培養基終止。

5.根據權利要求2或4所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述小鼠骨髓瘤SP2/0細胞與脾細胞的個數比為1:5。

6.根據權利要求2所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述檢測包括：液體和半固體融合板檢測。

7.根據權利要求6所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述液體融合板檢測包括：待融合板換液細胞長至中等大小約1萬個細胞以上開始檢測，在競爭法ELISA質控合格后挑選陽性孔作亞克隆。

8.根據權利要求6所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述半固體融合板檢測包括：常規細胞融合后，用甲基纖維素半固體培養基重懸細胞沉淀，重懸于20ml 2％甲基纖維素濃度的半固體培養基，于細胞培養皿中培養；7-10天后觀察培養皿中細胞克隆的大小以及數量，在體式顯微鏡下挑出至20％胎牛血清的HT培養基中培養2-3天后進行效價檢測，在競爭法ELISA質控合格作亞克隆。

9.如權利要求1所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的應用，其特征在于：所述雜交瘤細胞株用于制備抗甲氨蝶呤單克隆抗體，所述單克隆抗體可用于特異性識別甲氨蝶呤。

10.根據權利要求9所述的分泌甲氨蝶呤單抗的雜交瘤細胞株的應用，其特征在于：所述抗甲氨蝶呤單克隆抗體的制備方法包括如下步驟:將所述雜交瘤細胞注射預先用弗氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集所述小鼠的腹水，所述腹水經過預處理后純化。