[發明專利]基于特異識別AFB1納米抗體的親和吸附材料

在審

• 申請號: 201710265831.5
• 申請日: 2015-12-02
• 公開（公告）號: CN107159170A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 涂追;許楊
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: B01J20/281
• 分類號: B01J20/281;B01J20/30;B01D15/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種基于單域重鏈抗體(又稱納米抗體技術)的免疫親和吸附材料，特別是針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料。

技術背景

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌產生的劇毒次級代謝產物。它們的化學結構類似，為二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃曲霉毒素B₁(AFB₁)、B₂(AFB₂)、G₁(AFG₁)、G₂(AFG₁)和M₁(AFM₁)等。在天然污染的食品和飼料中，AFB₁的污染最為常見，其毒性和致癌性也最強，被世界衛生組織的癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物。世界各國及地區指定了嚴格的黃曲霉毒素限量標準，例如歐盟嬰幼兒食品中AFB₁允許量≤0.10μg/kg。

現有的黃曲霉毒素檢測方法主要有儀器分析法、免疫分析法以及薄層層析法。其中儀器分析法具有靈敏度高、準確性和重復性好等優點，但是對于分析樣品前處理要求較高，需要盡量去除樣品中的雜質以減少對后續檢測的干擾。傳統的前處理方法有液相萃取、固相萃取等，處理過程繁瑣且特異性不高。親和層析技術基于配基與待測物質之間特異性的識別，可通過一步操作實現對復雜混合樣品中待測物的分離純化。目前使用的黃曲霉毒素親和純化介質一般采用多克隆抗體或單克隆抗體作為配基，存在不耐有機試劑、活性迅速降低的問題。因此，需要開發活性高、穩定性好的新型配基替換傳統抗體。單域重鏈抗體是由羊駝重鏈抗體的可變區組成，又稱為納米抗體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產等特性，相較于傳統抗體具有明顯的優勢。

發明內容

本發明的目的是提供一種針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料及其應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料(基于特異識別AFB1納米抗體的親和吸附材料)包括載體和配基，所述配基為單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:11、SEQ ID NO.:13所示的氨基酸序列。該配基可特異性識別黃曲霉毒素。

所述配基還可以為在前述序列的單域重鏈抗體基礎上通過隨機或定點突變技術進行改造所獲得的能與黃曲霉毒素特異性結合的抗體。

所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。

上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備方法，其特征為：

所述載體為磁珠時，制備方法為：取1mg羧基磁珠于離心管中，加入500～1000μl活化緩沖液(10mM，NaH₂PO₄，pH6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入1～5mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后，靜置30min。用偶聯緩沖液(10mM，Na₂HPO₄，pH 7.4)洗滌磁珠3遍，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室溫反應2～6h，得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠；

所述載體為瓊脂糖凝膠微球時，制備方法為：將CNBr活化的干膠用0.1M HCl洗滌10～15次，每次平衡5～10min。用偶聯緩沖液(10mM，Na₂HPO₄，pH 7.4)洗滌5～15次，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室溫反應2～10h，得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料；

所述載體為硅膠微球時，制備方法為：將硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS，10mM，pH 6.0)交替洗滌5～10次，用PBS緩沖液懸浮硅膠微球，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度1～10mg/ml的碳二亞胺(EDC)，迅速混勻，4℃攪拌反應12～24h，得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。

將上述免疫親和吸附材料(載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球)裝填至層析柱，即得到黃曲霉毒素免疫親和層析柱，方法為：根據層析柱容量，取適量上述免疫親和吸附材料于層析柱，加入5～10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 7.4)洗滌后，4℃，保存于20％乙醇溶液。

共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠無需裝柱，直接吸附后磁鐵分離。