[發明專利]人間充質干細胞源外泌體生物活性制劑的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201710262634.8
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN106913583A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 劉家權;張滌平;郭子寬;陳賢光;錢開誠;魯立
• 申請（專利權）人: 深圳市賽歐細胞生物科技有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61P17/00;A61P17/18;C12N5/0775
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所44242
• 代理人: 任哲夫

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種人間充質干細胞源外泌體生物活性制劑的制備方法及應用。

背景技術

眾所周知，正常細胞，以及腫瘤細胞，都需要通過細胞分泌載體進行細胞間通信，以維持生理狀態和活動。其中，外泌體是一種重要的細胞間通信載體，能夠由所有種類的細胞產生，并已經被發現于各類體液當中，包括血液、淋巴液、尿液和乳汁。近三十年的研究結果表明，外泌體攜帶著豐富的細胞源物質，包括脂質體、蛋白質、mRNA、非編碼RNA，乃至DNA片段。外泌體并非簡單的細胞分子垃圾，它們能夠被其他細胞所吸收。因此，外泌體可以在細胞間傳遞生物信息，從而在細胞生理功能方面扮演著重要角色。特別地，外泌體也參與了某些疾病的進展過程，包括腫瘤和神經退行性疾病。隨著對外泌體的研究不斷深入，人們對于外泌體在人類健康與疾病方面極其復雜和深奧的作用機理，有了很深刻的認識和理解，進而開始留意外泌體對于疾病防治、人體保健，尤其是抗衰老方面的臨床應用和美容應用。

外泌體參與人體正常生理活動中的維持階段，例如干細胞的維持，以及組織修復。研究表明，在人體的發展和分化過程中，外泌體起著形態發生因子轉移載體的作用。這些外泌體首先由供體細胞釋放，然后在鄰近組織周圍擴散，形成不同的濃度帶，最后完成細胞間通信的過程。特別重要的是，已有多項研究發現，干細胞釋放的外泌體對于受傷組織，尤其是老化皮膚的再生與復原，起著十分關鍵的作用。

現有技術中，大多數美容制劑的抗衰老效果不理想，而且美容效果維持時間較短，需要經常使用，人力成本和時間成本較高。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于克服現有的美容制劑抗衰老效果不明顯，很少用到外泌體作為原料的技術瓶頸，從而提出一種人間充質干細胞源外泌體的緩釋美容制劑的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明公開了一種間充質干細胞源外泌體生物活性制劑的制備方法，所述制劑的制備方法如下：

1)稱取殼聚糖50-400mg，溶解于25-200mL的稀醋酸中，得到殼聚糖溶液；

2)稱取人間充質干細胞源外泌體凍干粉1-10mg、葡糖氨基葡聚糖2-20mg、透明質酸2-20mg，溶解于10-100mL甘油中，得到外泌體溶液；

3)將所述的外泌體溶液滴加到所述殼聚糖溶液中，得到外泌體的殼聚糖納米顆粒混懸液；

5)將所述混懸液進行離心處理，收集沉淀物，然后洗滌并干燥處理，得到所述源外泌體緩釋美容制劑。

優選的，所述殼聚糖為200mg，稀醋酸為100mL，人間充質干細胞源外泌體凍干粉為5mg、葡糖氨基葡聚糖為10mg、透明質酸為10mg，甘油為50mL。

優選的，所述外泌體的外膜為磷脂雙層結構，所述外泌體內部含有micro-RNA、所述外泌體源細胞的mRNA、DNA和核酸中的至少一種。

優選的，所述外泌體的獲取方法步驟如下：

a)對人間充質干細胞進行培養，培養階段在細胞培養基中添加干擾素、EPO和PDGF-BB；

b)對培養后的干細胞進行預處理；

c)在預處理后的培養基的上清液中提取所述人臍帶間充質干細胞源外泌體。

5、如權利要求4所述的制劑，其特征在于，所述步驟1)中，所述稀醋酸濃度為0.5％。

優選的，所述步驟4)中，所述離心處理的速度為10000r/min，時間為30分鐘；所述步驟3)的反應時間為30分鐘；所述步驟4)中，所述洗滌的次數為3次。

優選的，所述所述預處理的具體步驟為：

1)將人傳代MSC進行無血清懸浮培養，并調整細胞濃度為1.0×10⁶/ml；

2)按照10⁶/150mm大培養皿接種，培養至細胞融合度至70-80％，培養時間為2-3天；

3)吸除培養皿中的液體，并用alpha-MEM液體培養基對培養皿進行洗滌；

4)在150mm培養皿中再次加入20ml的alpha-MEM；

5)依次加入重組人干擾素、PDGF-BB和EPO；

7)在37℃，5％的CO₂條件下培養96小時，收集得到MSC培養液。

優選的，所述MSC培養液中干擾素的濃度為10U/ml～600U/ml、PDGF-BB的濃度為2ng/ml～60ng/ml，EPO的濃度為0.1IU/ml～5IU/ml。

優選的，所述步驟2)的預處理的具體為：

1)取所述MSC培養液的上清液，進行離心處理，去除細胞碎片；