[發明專利]一種不含蛋白和血清的細胞凍存液及其制備方法

在審

• 申請號: 201710259545.8
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN106993606A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: 楊勇;劉永雙;謝慧慧
• 申請（專利權）人: 蘇州新賽美生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于細胞保存技術領域，具體涉及一種不含蛋白和血清的細胞凍存液及其制備方法。

背景技術：

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。凍存細胞經典方案往往是使用胎牛血清(FBS)與二甲基亞砜(DMSO)混合培養基后，應用于細胞的凍存。但是該方法有不少瑕疵。如，血清中的蛋白甚至潛在的病原體污染會對生物制品的安全性造成風險；此外胎牛血清會對動物造成一定潛在傷害，可能遇到無法通過歐美倫理審核的難題。

發明內容：

本發明公開了一種不含蛋白和血清的細胞凍存液及其制備方法，制備的即用型細胞凍存液，能有效地提高常規細胞、原代細胞與干細胞的復蘇后存活率與活力；產品質量穩定可靠、使用方便，助力科研工作者擺脫程序繁瑣、操作復雜、容易污染的傳統凍存方法，專注于后續實驗研究；本發明的細胞凍存液所含化學成分明確，無動物源性成分，可一步實現細胞凍存并長期在-80℃冰箱保存，保護細胞免受冰晶和溶質損傷。

為達到上述發明目的，本發明采用如下技術方案：一種不含蛋白和血清的細胞凍存液，所述不含蛋白和血清的細胞凍存液包括以下質量分數或體積分數的組分：

質量分數為1％-3％的聚乙烯醇、質量分數為2.5-3.5％的葡萄糖、質量分數為0.15-0.20％的氯化鈉、質量分數為0.005-0.008％的磷酸二氫鈉、質量分數為0.03-0.06％的磷酸氫二鈉、質量分數為0.04-0.06％的4-羥乙基哌嗪乙磺酸；質量分數0.002-0.005％的乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、體積分數為5％-12％的二甲基亞砜；其余為雙蒸水。

優選的，所述不含蛋白和血清的細胞凍存液包括以下質量分數或體積分數的組分：

質量分數為1.5％-2.5％的聚乙烯醇、質量分數為2.8-3.2％的葡萄糖、質量分數為0.18-0.20％的氯化鈉、質量分數為0.006-0.008％的磷酸二氫鈉、質量分數為0.035-0.055％的磷酸氫二鈉、質量分數為0.04-0.06％的4-羥乙基哌嗪乙磺酸；質量分數0.002-0.005％的乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、體積分數為7％-10％的二甲基亞砜；其余為雙蒸水。

上述技術方案中，所述聚乙烯醇的分子量為40000-60000。聚乙烯醇外觀為白色粉末，是一種水溶性高分子聚合物，具有極高的安全性的有機物，對細胞無毒，無副作用，在本發明中加入聚乙烯醇的高分子聚合物能夠在細胞凍存溫度降低時起到緩沖作用；加入了葡萄糖，為細胞凍存時提供能量，此外其他為緩沖液，為細胞凍存時提供合適的離子平衡和pH等環境。

本發明還公開了上述不含蛋白和血清的細胞凍存液的制備方法，包括以下步驟：

(1)在容器中，加入雙蒸水，然后加入聚乙烯醇，攪拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，攪拌；再加入二甲基亞砜，攪拌得到混合液；

(2)在無菌條件下將所述混合液過濾，得到不含蛋白和血清的細胞凍存液。

優選的，所述過濾為將所述混合液依次用0.45um濾膜、0.22um濾膜過濾。先用0.45um濾膜經行澄清過濾，然后再進行0.22um過濾除菌，即獲得無血清和蛋白來源的細胞凍存液，無雜質污染。

本發明進一步公開了上述不含蛋白和血清的細胞凍存液在保存細胞中的應用。

本發明還公開了一種凍存細胞的方法，包括以下步驟：

(1)在容器中，加入雙蒸水，然后加入聚乙烯醇，攪拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，攪拌；再加入二甲基亞砜，攪拌得到混合液；

(2)在無菌條件下將所述混合液過濾，得到不含蛋白和血清的細胞凍存液；

(3)將細胞懸浮液置于離心管中，離心處理后棄上清、收集培養細胞沉淀；然后加入細胞凍存液，制成細胞混合液；然后將細胞混合液置入-80℃，完成細胞凍存。