[發明專利]一種不含蛋白和血清的細胞凍存液及其制備方法

在審

• 申請號: 201710259545.8
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN106993606A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: 楊勇;劉永雙;謝慧慧
• 申請（專利權）人: 蘇州新賽美生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種不含蛋白和血清的細胞凍存液，其特征在于，所述不含蛋白和血清的細胞凍存液包括以下質量分數或體積分數的組分：

質量分數為1％-3％的聚乙烯醇、質量分數為2.5-3.5％的葡萄糖、質量分數為0.15-0.20％的氯化鈉、質量分數為0.005-0.008％的磷酸二氫鈉、質量分數為0.03-0.06％的磷酸氫二鈉、質量分數為0.04-0.06％的4-羥乙基哌嗪乙磺酸；質量分數0.002-0.005％的乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、體積分數為5％-12％的二甲基亞砜；其余為雙蒸水。

2.根據權利要求1所述不含蛋白和血清的細胞凍存液，其特征在于，所述不含蛋白和血清的細胞凍存液包括以下質量分數或體積分數的組分：

質量分數為1.5％-2.5％的聚乙烯醇、質量分數為2.8-3.2％的葡萄糖、質量分數為0.18-0.20％的氯化鈉、質量分數為0.006-0.008％的磷酸二氫鈉、質量分數為0.035-0.055％的磷酸氫二鈉、質量分數為0.04-0.06％的4-羥乙基哌嗪乙磺酸；質量分數0.002-0.005％的乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、體積分數為7％-10％的二甲基亞砜；其余為雙蒸水。

3.根據權利要求1或者2所述不含蛋白和血清的細胞凍存液，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量為40000-60000。

4.權利要求1所述不含蛋白和血清的細胞凍存液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)在容器中，加入雙蒸水，然后加入聚乙烯醇，攪拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，攪拌；再加入二甲基亞砜，攪拌得到混合液；

(2)在無菌條件下將所述混合液過濾，得到不含蛋白和血清的細胞凍存液。

5.根據權利要求4所述不含蛋白和血清的細胞凍存液的制備方法，其特征在于，所述過濾為將所述混合液依次用0.45um濾膜、0.22um濾膜過濾。

6.權利要求1所述不含蛋白和血清的細胞凍存液在保存細胞中的應用。

7.一種凍存細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)在容器中，加入雙蒸水，然后加入聚乙烯醇，攪拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，攪拌；再加入二甲基亞砜，攪拌得到混合液；

(2)在無菌條件下將所述混合液過濾，得到不含蛋白和血清的細胞凍存液；

(3)將細胞懸浮液置于離心管中，離心處理后棄上清、收集培養細胞沉淀；然后加入細胞凍存液，制成細胞混合液；然后將細胞混合液置入-80℃，完成細胞凍存。

8.根據權利要求7所述凍存細胞的方法，其特征在于，所述過濾為將所述混合液依次用0.45um濾膜、0.22um濾膜過濾；所述離心處理為1000rmp處理5分鐘；將細胞混合液分裝于已標記的凍存管中，然后置入-80℃，完成細胞凍存。

9.根據權利要求7所述凍存細胞的方法，其特征在于，所述細胞混合液中，細胞濃度為5×10⁵-1×10⁷/mL。

10.一種細胞凍存復蘇的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)在容器中，加入雙蒸水，然后加入聚乙烯醇，攪拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，攪拌；再加入二甲基亞砜，攪拌得到混合液；

(2)在無菌條件下將所述混合液過濾，得到不含蛋白和血清的細胞凍存液；

(3)將細胞懸浮液置于離心管中，離心處理后棄上清、收集培養細胞沉淀；然后加入細胞凍存液，制成細胞混合液；然后將細胞混合液置入-80℃，完成細胞凍存；

(4)取出凍存的細胞，放入37℃水浴槽中解凍；待細胞混合液完全融化后，加入細胞培養基；然后于1000rmp離心處理5分鐘，收集凍存細胞沉淀，移去上清液；再加入新鮮細胞培養基，完成細胞復蘇。