[發明專利]一種生產A82846B的基因工程菌及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710258568.7
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN108728390B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 陳少欣;王偉艷;馬巧慧;沈曉放;楊松柏
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;C12R1/01
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

本發明公開了一種生產A82846B的基因工程菌，即在出發菌東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的基因組中整合了內源鹵化酶基因chaA，或者與內源鹵化酶基因chaA同源性不小于84％的外源鹵化酶基因的工程菌。本發明還公開了上述基因工程菌的制備方法，及將上述基因工程菌發酵且從發酵液中獲得A82846B的方法。本發明基因工程菌過表達導入的鹵化酶基因并生產A82846B，其A82846B的產量(mg/L)或目的產物在總產物中的占比有顯著地提高，本發明提高了生產效率及降低生產成本的同時，還減少了環境污染。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種生產A82846B的基因工程菌及其構建/制備方法與應用。

背景技術

隨著抗菌藥物應用的增多，細菌的耐藥性問題日益嚴重，耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)在皮膚感染中的比例逐年上升。臨床通常使用糖肽類抗生素萬古霉素和替考拉寧等治療由MRSA引起的嚴重感染。然而，耐萬古霉素菌株的迅速出現，使得尋找新型抗MRSA抗菌藥物迫在眉睫。奧利萬星(oritavancin)是第二代糖肽類抗生素，于2014年8月由美國FDA批準上市，用于治療敏感革蘭氏陽性菌(包括MRSA)引起的急性細菌性皮膚和結構感染，是繼萬古霉素和替考拉寧等第一代糖肽類抗生素之后的新型有效的抗生素。

A82846B是奧利萬星的合成前體，分子式是C86H97Cl2N10O26，它是萬古霉素的結構類似物，結構與多數糖肽類抗生素的結構類似。目前，大規模微生物發酵法是生產A82846B的主要方式，發酵液還會有A82846A和A82846C產生。A82846A和A82846C都是A82846B的結構類似物，三者的結構式如下式1所示，三者的區別在于糖肽骨架的2位和6位氨基酸殘基的取代基上的氯原子，A82846B在2和6位取代基上各有一個氯原子，A82846A只在2位取代基有一個氯原子，A82846C沒有氯原子(表1)?？咕钚砸来问茿82846BA82846AA82846C。氯原子能促使抗生素形成二聚體，形成活性口袋，更利于與細菌結合，因此含有兩個氯的A82846B抗菌活性更強。發酵液中A82846A和A82846C產生，給A82846B的生產和后續的分離純化增加了成本。

表1.A82846三種產物R1和R2位點的基團組成

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術中上述A82846B發酵過程中，副產物A82846A和A82846C產生，給生產A82846B及后續的分離純化增加時間及經濟成本等缺陷；提供一種生產A82846B的基因工程菌及其構建方法和應用，可以利用基因工程技術提高生產A82846B的效率，降低成本。

隨著分子生物學技術的發展，利用基因工程手段能夠定向改造或修飾抗生素的生物合成基因簇，獲得新型抗生素或提高抗生素產量。然而，本發明的難點在于A82846B目標產物及其副產物A82846A和A82846C的產生在其生產菌中的基因調控機理尚未清楚，特別是A82846A、A82846B與A82846C間的相互轉化，以及與其內部存在的鹵化酶的關系均不清楚。本發明通過諸多研究和試驗，發現將內源鹵化酶基因導入產A82846B的宿主菌，使之過表達，或在宿主菌中外源表達與該內源鹵化酶基因同源性較高的鹵化酶基因，將A82846A和A82846C轉化為A82846B，獲得的工程菌產物中各物質的含量發生了變化，副產物A82846A和A82846C的產量和/或比例顯著降低，和/或A82846B產量和/或比例明顯提高。

因此，本發明的技術方案之一是：一種生產A82846B的基因工程菌，其是在生產A82846B的出發菌東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的基因組中整合了內源鹵化酶基因chaA，或者與所述內源鹵化酶基因chaA同源性為約84％或84％以上且來源于糖肽類抗生素生產菌的外源鹵化酶基因的工程菌。