[發明專利]一種番茄斑萎病毒屬病毒基因及其應用

有效

• 申請號: 201710251104.3
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN106929520B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 董家紅;鄭寬瑜;張仲凱;吳闊;張麗珍
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116
• 代理人: 姜開俠;謝喬良

1.一種番茄斑萎病毒屬病毒基因，其特征在于所述番茄斑萎病毒屬病毒為辣椒黃化環斑病毒，其基因的堿基序列如SEQ ID NO:2所示，能夠編碼病毒的運動蛋白NSm和糖蛋白Gn或Gc；如SEQ ID NO:2所示的病毒基因序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。

2.一種用于檢測番茄斑萎病毒屬病毒基因的檢測試劑盒，其特征在于所述番茄斑萎病毒屬病毒基因為如SEQ ID NO:2所示的辣椒黃化環斑病毒基因，試劑盒含有濃度為100pmol的正義引物50μL、濃度為100pmol的反義引物50μL、濃度為100pmol的探針50μL、RT-PCR反應液2.5ml；正義引物的序列為SEQ ID No:2中第1320-1340位，反義引物的序列為SEQ ID No:2中第2700-2720 位的互補序列，探針的序列為SEQ ID No:2中第1986-2200位。

3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于操作步驟如下：

病樣總RNA的提取，去感病植物，液氮研磨后，提取病樣的總RNA，用12μL總RNA為模板，1μL100μM下游引物混合，cDNA合成體系為20μL，70℃預變性10min后，迅速插入冰上5min，加入5×RT Buffer 4μL，10mmol/L dNTP 2μL，5U/μL M-MLV 1μL，40U/μL RNase Inhibitor 1μL，42℃延伸90min；以cDNA為模板或以帶有進行PCR擴增；反應體系為50μL： cDNA 3μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP1μL，rTaq 1μL，10′buffer 5μL，H₂O 38μL；反應條件為：94℃下預變性4min；然后94℃下變性1min，55℃退火1 min，72℃下延伸1 min 30s，循環擴增30次；最后72℃下延伸10min；

PCR產物用UNIQ-10柱式PCR純化試劑盒或UNIQ-10柱式膠回收試劑盒回收，回收的片段用于作為探針，或連接到pMD18-T載體上，連接體系：2.5μL Ligation mix，0.5μL pMD18-T，2μL PCR回收產物，16℃的條件下連接過夜；42℃熱激轉化到大腸桿菌DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆，測序。