[發明專利]基于背景熒光猝滅?免疫層析測定牛奶中林可霉素的方法

在審

• 申請號: 201710250536.2
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN107037216A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 王玉文;吳曉霞;李新霞;李久彤;張唯;徐莉華
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58
• 代理公司: 烏魯木齊合縱專利商標事務所65105
• 代理人: 褚志武,湯建武

技術領域

本發明涉及牛奶檢測技術領域，是一種基于背景熒光猝滅-免疫層析測定牛奶中林可霉素的方法。

背景技術

林可霉素(Linconycin，LIN)屬于林可胺類抗生素，對于革蘭氏陽性菌有較強抗菌作用，對支原體也有抑菌作用，但對革蘭氏陰性菌無效。臨床上主要應用于葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎球菌及厭氧菌所致的呼吸道感染、皮膚軟組織感染、女性生殖道及盆腔感染和厭氧菌所致的腹腔感染等。還可用于鏈球菌和葡萄球菌所致的敗血癥、骨和關節感染、慢性骨和關節感染的外科輔助治療、葡萄球菌所致的急性血源性骨髓炎等。作為獸藥，常被添加在飼料中或直接乳房注射治療奶牛的乳房炎，但殘留在乳腺管中的林可霉素，會經乳汁排出，導致生鮮乳中抗生素殘留，對消費者引起機體的過敏反應或抗藥性。各國都對其有限量要求，中華人民共和國農業部公告第253號-2002牛奶中最高殘留限量為100ng/mL。

在進出口動物源性食品SNT2218-2008中林可胺類藥物殘留量檢測方法中林可霉素的檢測方法為液相色譜-串質譜法和質譜法。在中華人民共和國國家標準GB/T4789.27-2008規定鮮乳中林可霉素殘留的檢驗方法為嗜熱鏈球菌抑制法和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法。文獻報道有酶聯免疫吸附法(ELISA)、高效液相色譜法、膠體金免疫層析法等。嗜熱鏈球菌抑制法和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法試驗價格低廉，但樣品前處理過程繁瑣，重現性差；高效液相色譜法、液相色譜串聯質譜法等，這類方法靈敏度高，特異性好，但是此類儀器沒有便攜性，價格昂貴，樣品前處理復雜；ELISA方法靈敏度較高、快速、經濟，但在檢測實驗過程需多次洗板，重復性較差，試劑需低溫保存等，適用于實驗室大量樣本初篩，不適合現場快速檢測；膠體金免疫層析因快速、簡便且經濟實用，在食品檢測的大量樣本篩查中表現出較強的優勢，但只能用于定性檢測，而不能進行定量，篩選后的陽性樣本需送實驗室進行進一步定量分析。

發明內容

本發明提供了一種基于背景熒光猝滅-免疫層析測定牛奶中林可霉素的方法，克服了上述現有技術之不足，其能有效解決現有鮮乳中林可霉素殘留的檢驗方法存在樣品前處理過程繁瑣、重現性差、不適合現場快速檢測和不能進行定量分析的問題。

本發明的技術方案是通過以下措施來實現的：一種基于背景熒光猝滅-免疫層析測定牛奶中林可霉素的方法，按下述步驟進行：第一步，將林可霉素標準曲線方程和名稱輸入二維碼制碼器，制成林可霉素二維碼，然后把林可霉素二維碼粘貼在林可霉素試紙條上的二維碼粘貼處，得到林可霉素檢測卡；第二步，取待檢測樣品200μL至固定有金標抗體的小試杯中，充分混勻后吸取100μL滴加至林可霉素檢測卡上的加樣孔內，室溫下層析10min；第三步，層析后將林可霉素檢測卡插入熒光免疫分析儀的插卡口，點擊測樣，熒光免疫分析儀的顯示屏上就會顯示出待檢測樣品名稱和待檢測樣品中林可霉素的濃度。

下面是對上述發明技術方案的進一步優化或/和改進：

上述林可霉素標準曲線方程按下述方法得到：第一步，林可霉素儲備液的配置，取林可霉素標準物質，用PBS配成1μg/mL的林可霉素溶液，得到林可霉素儲備液；第二步，林可霉素系列濃度標準溶液的配置，將林可霉素儲備液用標準牛奶樣依次配成10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL和60ng/mL的林可霉素系列溶液，得到林可霉素系列濃度標準溶液；第三步，取標準牛奶樣200μL、林可霉素系列濃度標準溶液各200μL至固定有金標抗體的小試杯中，充分混勻后吸取100μL滴加至林可霉素試紙條上的加樣孔內，室溫下層析10min；第四步，層析后將林可霉素試紙條插入熒光免疫分析儀的插卡口，點擊測樣，熒光免疫分析儀掃描林可霉素試紙條上的T線和C線，獲得樣品F₁/F₀的比值；第五步，以溶液中林可霉素的濃度為橫坐標，相對應的F₁/F₀為縱坐標，得到林可霉素標準曲線方程y＝-5×10^-6x³+0.0004x²+0.0016x+0.4892。

上述標準牛奶樣為經檢測不含有林可霉素的牛奶樣。

上述待檢測樣品為待檢測牛奶。

本發明測定牛奶中林可霉素的檢測限為0.088μg/kg，最優加樣量為100μL，最優層析時間為10min；本發明較現有方法靈敏度高、反應時間短、操作簡便，可實現牛奶中林可霉素現場快速定量檢測，為廣泛應用于食品安全領域奠定了基礎。

附圖說明