[發(fā)明專利]一種人臍帶組織消化酶及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710241716.4
• 申請(qǐng)日: 2017-04-14
• 公開（公告）號(hào): CN106867981A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈曉延
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島青春派生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/26
• 分類號(hào): C12N9/26;C12N9/50;C12N9/22;C12N5/0775
• 代理公司: 蘇州國(guó)誠(chéng)專利代理有限公司32293
• 代理人: 陳文爽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及了一種人臍帶組織消化酶及其制備方法。

背景技術(shù)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesnchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。快速準(zhǔn)確地分離高活力的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是研發(fā)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞各項(xiàng)功能的前提。

目前，從臍帶中分離MSCs常用的方法有組織貼壁法、單酶法(膠原酶)、雙酶法(膠原酶、胰蛋白酶)以及三酶法(膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶)消化法。

組織貼壁法操作簡(jiǎn)單，但存在以下幾種問題：不利于MSCs游離，造成臍帶組織的浪費(fèi)；華通氏膠、破碎細(xì)胞的DNA增加了培養(yǎng)基的黏度；細(xì)胞貼壁緩慢，影響培養(yǎng)周期。

酶消化法在酶的選擇與消化時(shí)間上沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，存在的問題主要有：組織塊徹底消化時(shí)間長(zhǎng)；消化酶種類單一，不能徹底消化透明質(zhì)酸、膠原纖維；單純?cè)黾用傅膭┝浚瑫?huì)破壞游離出的細(xì)胞表面蛋白如粘附因子，使細(xì)胞活力與貼壁能力受到影響。

發(fā)明內(nèi)容

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種用于分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的組織消化酶，該消化酶中除了膠原酶、透明質(zhì)酸酶以外，還增加了DNA酶，大大縮短了消化時(shí)間，使消化粘稠度降低，添加青霉素和鏈霉素可有效防止樣本在采集的過程中污染以及運(yùn)輸過程中細(xì)菌的滋生。

一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶30-50份、透明質(zhì)酸酶20-40份。

優(yōu)選的，所述組織消化酶還包括DNA酶0.1-0.8份。

優(yōu)選的，組織消化酶還包括抗生素。

優(yōu)選的，所述抗生素包括青霉素4-10份、鏈霉素15-23份。

優(yōu)選的，所述組織消化酶包括膠原酶40份、透明質(zhì)酸酶20份、DNA酶0.4份、青霉素6份、鏈霉素20份。

一種人臍帶組織消化酶的制備方法，方法步驟如下：

S1：在無菌安全柜內(nèi)稱取膠原酶，加入DMEM培養(yǎng)基中；

S2：稱取透明質(zhì)酸酶加入S1制得的培養(yǎng)基中；

S3：稱取DNA酶加入S2制得的培養(yǎng)基中；

S4：稱取青霉素和鏈霉素加入S3制得的培養(yǎng)基中；

S5：將S4制得的培養(yǎng)基經(jīng)過0.22μm的濾網(wǎng)過濾，放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步的，所述DMEM培養(yǎng)基為低糖型。

一種人臍帶組織消化酶可應(yīng)用于分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

臍帶是由卵黃囊和尿囊所構(gòu)成，通常是由2條較細(xì)的臍動(dòng)脈與1條較粗的臍靜脈所組成，我們?cè)谥苽涞倪^程中會(huì)剔除動(dòng)脈和靜脈，但是臍帶外圍由一層柔軟的膠狀物包裹著，稱為華通氏膠，用以保護(hù)臍帶內(nèi)的血管。華通氏膠為構(gòu)成臍帶的凝膠狀物質(zhì)，主要成份是黏多糖，也含有成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是一種黏膜組織。透明質(zhì)酸酶為一種能水解透明質(zhì)酸的酶(透明質(zhì)酸為組織基質(zhì)中具有限制水分及其它細(xì)胞外物質(zhì)擴(kuò)散作用的成分)，用于暫時(shí)降低細(xì)胞間質(zhì)的粘性。

膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原酶的化學(xué)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。在臍帶消化酶中添加膠原酶就是為了特異性的水解臍帶組織中的蛋白質(zhì)，使間充質(zhì)干細(xì)胞充分的暴露出來。在膠原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分離細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞黏附聚集。

抗生素是青霉素與鏈霉素。自然環(huán)境下(不考慮人為產(chǎn)生的抗藥性)，對(duì)青霉素不敏感的微生物絕大多數(shù)對(duì)鏈霉素敏感，反之亦然。兩種抗生素搭配可以控制幾乎全部常見細(xì)菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果在于：

本發(fā)明提出的一種人臍帶組織消化酶包括膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNA酶，該消化酶組合物性質(zhì)溫和，可有效降低消化粘稠度，對(duì)細(xì)胞損傷小；該組織消化酶的酶解速率高，縮短了臍帶組織的消化時(shí)間，分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更加優(yōu)良的增殖活性和分化能力；此外本發(fā)明的組織消化酶中還添加青霉素和鏈霉素，可有效防止樣本在采集過程中的污染以及運(yùn)輸過程中細(xì)菌的滋生。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說。

實(shí)施例1

一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶30份、透明質(zhì)酸酶40份、DNA酶0.1份、青霉素4份、鏈霉素23份。

一種人臍帶組織消化酶的制備方法，方法步驟如下：

S1：在無菌安全柜內(nèi)稱取膠原酶，加入DMEM培養(yǎng)基中；