[發(fā)明專利]一種應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710240623.X
• 申請(qǐng)日: 2017-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN107058219A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張鈺;朱灝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海萊馥生命科學(xué)技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 上海信好專利代理事務(wù)所(普通合伙)31249
• 代理人: 周乃鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種牙髓干細(xì)胞的制備方法，具體涉及一種應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞是未充分分化的細(xì)胞，具有自我更新與分化為特定組織器官的能力。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)又稱牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是指牙髓內(nèi)可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓細(xì)胞，由Gronthos等于2000年首次提出，它具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的免疫表型。

牙髓干細(xì)胞具有來源豐富、采集方便、免疫原性低、無倫理爭議等優(yōu)點(diǎn)。因此，牙髓干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)和組織工程修復(fù)中有著廣泛的應(yīng)用前景。牙髓干細(xì)胞在牙周組織缺損、牙周炎、牙髓組織再生中顯示出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。大規(guī)模培養(yǎng)穩(wěn)定可靠的DPSCs已成為一種趨勢(shì)。

以往DPSCs增殖能力較一般，Nelson F.Lizier等發(fā)表的文獻(xiàn)“Scaling-up of Dental Pulp Stem Cells Isolated from Multiple Niches”（文獻(xiàn)來源：PLoS One. 2017; 7(6)），其記載了P3代最高培養(yǎng)出1.8*10⁸個(gè)。

對(duì)干細(xì)胞表面的分子標(biāo)記進(jìn)行確認(rèn)是分離鑒定干細(xì)胞常用的手段，目前發(fā)現(xiàn)DPSCs表達(dá)中胚層標(biāo)記物Stro-1和CD146。Stro-1是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的早期細(xì)胞標(biāo)志分子之一，能夠鑒定DPSCs的未分化狀態(tài)。Farzaneh Aghajani等發(fā)表的文獻(xiàn)“Comparative Immunophenotypic Characteristics, Proliferative Features, and Osteogenic Differentiation of Stem Cells Isolated from Human Permanent and Deciduous Teeth with Bone Marrow”（文獻(xiàn)來源：Mol Biotechnol (2016) 58:415–427），其記載了DPSCs的表面標(biāo)志Stro-1表面標(biāo)志一般＜5%。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供制備牙髓干細(xì)胞的方法，該方法縮短了原代培養(yǎng)的時(shí)間，而且增殖能力強(qiáng)，制備的牙髓干細(xì)胞具有很好的干細(xì)胞特征，分化潛力強(qiáng)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法，該方法包含：

步驟1：選取牙齒樣本，破牙冠，從牙齒樣本的髓腔中抽取牙髓，使用緩沖溶液洗滌牙髓，將牙髓分成若干小塊，放入離心管內(nèi)；

步驟2：配制消化液，該消化液包含：氯化鈉注射液、膠原酶Ⅰ、分散酶Ⅱ（DispaseⅡ）、白蛋白、鎂鹽和鈣鹽，將該消化液加入步驟1中的離心管內(nèi)，將離心管密封，混合均勻后在37℃下消化；

步驟3：待離心管內(nèi)的小塊松散后，對(duì)離心管表面滅菌處理，加入消化終止液，終止消化；

步驟4：將步驟3得到的溶液進(jìn)行離心，去除上清液，在底部的沉淀加入MSC原代培養(yǎng)基，使沉淀重懸后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，在5%CO₂，37℃下，進(jìn)行原代培養(yǎng)；

步驟5：當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，收集上清液，并進(jìn)行超濾，收集上層濾網(wǎng)中的干細(xì)胞提取液，將該干細(xì)胞提取液加入到MSC原代培養(yǎng)基中，得到傳代培養(yǎng)基；

步驟6：將步驟5中下層沉淀的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基移出備用，用磷酸鹽緩沖液沖洗培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)瓶中加入稀釋的胰酶，將胰酶平鋪于培養(yǎng)瓶底部，進(jìn)行胰酶消化，消化時(shí)間不超過1min，加入上述備用的培養(yǎng)基終止消化；稀釋的胰酶為濃度為0.025%的胰酶；

步驟7：將步驟6消化得到的液體離心，底部沉淀的細(xì)胞加入到步驟5得到的傳代培養(yǎng)基中，混合均勻，按1×10²/cm²的細(xì)胞密度進(jìn)行種瓶，在5%CO₂，37℃的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

步驟8：重復(fù)上述步驟6和7，進(jìn)行若干次傳代培養(yǎng)；

步驟9：將細(xì)胞凍存液置于凍存管中，在4℃下進(jìn)行預(yù)冷，凍存管中加入步驟8細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)得到的干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為1.5×10⁶~2×10⁶/1.5mL/管，逐漸降溫至-80℃，24h之后將凍存的細(xì)胞放入-196℃的液氮罐中保存。

其中，所述的MSC原代培養(yǎng)基中包含：生長因子。