[發明專利]一種應用干細胞自身特性制備牙髓干細胞的方法

在審

• 申請號: 201710240623.X
• 申請日: 2017-04-13
• 公開（公告）號: CN107058219A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 張鈺;朱灝
• 申請（專利權）人: 上海萊馥生命科學技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海信好專利代理事務所(普通合伙)31249
• 代理人: 周乃鑫

1.一種應用干細胞自身特性制備牙髓干細胞的方法，其特征在于，該方法包含：

步驟1：選取牙齒樣本，破牙冠，從牙齒樣本的髓腔中抽取牙髓，使用緩沖溶液洗滌牙髓，將牙髓分成若干小塊，放入離心管內；

步驟2：配制消化液，該消化液包含：氯化鈉注射液、膠原酶Ⅰ、分散酶Ⅱ、白蛋白、鎂鹽和鈣鹽，將該消化液加入步驟1中的離心管內，將離心管密封，混合均勻后在37℃下消化；

步驟3：待離心管內的小塊被消化松散后，對離心管表面滅菌處理，加入消化終止液，終止消化；

步驟4：將步驟3得到的溶液進行離心，去除上清液，在底部的沉淀加入MSC原代培養基，使沉淀重懸后轉移至培養瓶中，在5%CO₂， 37℃下，進行原代培養；

步驟5：當細胞融合度達到80%-90%時，收集上清液，并進行超濾，收集上層濾網中的干細胞提取液，將該干細胞提取液加入到MSC原代培養基中，得到傳代培養基；

步驟6：將步驟5中下層沉淀的細胞接種到培養瓶中，待細胞融合度達到80%-90%時，將培養瓶內的培養基移出備用，用磷酸鹽緩沖液沖洗培養瓶，在培養瓶中加入稀釋的胰酶，將胰酶平鋪于培養瓶底部，進行胰酶消化，消化時間不超過1min，加入上述備用的培養基終止消化；稀釋的胰酶為濃度為0.025%的胰酶；

步驟7：將步驟6消化得到的液體離心，底部沉淀的細胞加入到步驟5得到的傳代培養基中，混合均勻，按1×10²/cm²的細胞密度進行種瓶，在5%CO₂，37℃的條件下進行傳代培養；

步驟8：重復上述步驟6和7，進行若干次傳代培養；

步驟9：將細胞凍存液置于凍存管中，在4℃下進行預冷，凍存管中加入步驟8細胞擴大培養得到的干細胞傳代培養基，細胞密度為1.5×10⁶~2×10⁶/1.5mL/管，逐漸降溫至-80℃，24h之后將凍存的細胞放入-196℃的液氮罐中保存；

其中，所述的MSC原代培養基中包含：生長因子。

2.根據權利要求1所述的應用干細胞自身特性制備牙髓干細胞的方法，其特征在于，在步驟1中，所述的緩沖溶液包含：0.9%氯化鈉注射液、10,000Units/mL青霉素和10,000μg/mL鏈霉素；

所述的氯化鈉注射液：青霉素：鏈霉素的體積比為198:1:1。

3.根據權利要求1所述的應用干細胞自身特性制備牙髓干細胞的方法，其特征在于，在步驟2中，所述的鎂鹽包含：氯化鎂；所述的鈣鹽包含：氯化鈣；

所述的消化液中各組分的濃度為：0.9%氯化鈉注射液、3%膠原酶Ⅰ、4%分散酶Ⅱ、1mol/L氯化鎂、200mg/mL氯化鈣和20%白蛋白；

所述的0.9%氯化鈉注射液：1mol/L氯化鎂：200mg/mL氯化鈣：20%白蛋白的體積比為1mL：5μL：5μL ：100μL；

所述的3%膠原酶Ⅰ的生物活性為270U/mg；

所述的4%分散酶Ⅱ的生物活性為0.85U/mg。

4.根據權利要求1所述的應用干細胞自身特性制備牙髓干細胞的方法，其特征在于，在步驟3中，所述的終止液包含：0.9%氯化鈉注射液和20%白蛋白，所述的0.9%氯化鈉注射液：20%白蛋白的體積比為9：1。

5.根據權利要求1所述的應用干細胞自身特性制備牙髓干細胞的方法，其特征在于，在步驟4中，所述的MSC原代培養基包含：人類間充質干細胞無血清基礎培養基、基質細胞衍生因子和L-谷氨酰胺；

所述的生長因子包含：成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、表皮生長因子和血管內皮生長因子；

所述的人類間充質干細胞無血清基礎培養基的體積：肝細胞生長因子的質量：表皮生長因子的質量：血管內皮生長因子的質量：基質細胞衍生因子的質量：L-谷氨酰胺的體積=100mL：1μg：2μg：2μg：2μg：100μL；

所述的成纖維細胞生長因子的生物活性為100 IU/mL。

6.根據權利要求1所述的應用干細胞自身特性制備牙髓干細胞的方法，其特征在于，在步驟4中，所述的培養瓶為經過處理的培養瓶，處理方法為：將貼壁試劑因子和磷酸鹽緩沖液以體積比10μL：1mL混合重懸后，加入培養瓶中，并搖晃培養瓶使貼壁試劑因子完全覆蓋住培養瓶底部。