[發明專利]一種分子接頭及其應用

有效

• 申請號: 201710240325.0
• 申請日: 2017-04-13
• 公開（公告）號: CN106906211B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 王弢;王景;李宗飛;代玉環;周美玲;杜帥
• 申請（專利權）人: 蘇州普瑞邁德醫學檢驗所有限公司;江蘇為真生物醫藥技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06;C40B80/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

本發明在優化illumina測序接頭基礎上，設計出具有穩定性好、與樣本DNA連接效率高、具有校正功能的分子接頭。該分子接頭能夠檢測突變頻率低至0.05％突變位點。該分子接頭用于鑒別樣本測序文庫構建過程中真實突變和操作過程引入的假陽性突變，此外，提供一種構建待測樣本測序文庫的方法。

技術領域

本發明涉及測序技術領域，用于受檢樣本建庫中的分子接頭及應用；同時應用于超低頻基因突變檢測的分子接頭及應用；尤其是具有鑒別功能的分子接頭制備及構建待測樣本測序文庫的方法。

背景技術

腫瘤是異質性細胞的混合體，測序可以檢測其中的罕見突變，二代測序具有多樣本、多基因的優勢，同時還可以發現未知的突變位點，所以二代測序可以用于腫瘤的早期篩查和診斷，復發監控，療效評估等。

ctDNA是腫瘤患者體液中游離的DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，來自于腫瘤細胞壞死或凋亡等過程釋放,存在于血液、尿液、腦脊液等體液中。ctDNA釋放入血，攜帶有腫瘤的相關信息，因此通過ctDNA的檢測可以反映腫瘤相關基因的特異性變異，進而了解腫瘤的特征。

因血漿中ctDNA含量極低，實驗過程復雜，樣本用量及實驗次數受限制，且樣本準備及測序前期文庫構建及雜交捕獲過程中存在損失，因此利用高通量測序(二代測序)技術獲取的有效數據率偏低；加之血漿中ctDNA樣本容易受基因組DNA的污染，導致測序背景噪音過高；此外測序過程中文庫富集、后續的雜交捕獲及測序都存在不同程度的氧化損傷，產生假陽性突變，將掩蓋樣本中的罕見突變,特別是血漿中有限的ctDNA，限制了檢測靈敏度。因此受檢樣本連接上傳統的接頭只能通過分子標簽區分不同的樣本，然而因樣本DNA量太低、背景信號過高、假陽性突變等原因，數據分析時很難剔除干擾，無法真實反映樣本DNA所攜帶的腫瘤信息，尤其是ctDNA的檢測。

發明內容

基于上述問題，本發明的目的是根據illumina測序平臺，優化illumina測序接頭設計出具有穩定性好、與樣本DNA連接效率高、具有校正功能的分子接頭。該分子接頭能夠檢測突變頻率低至0.05％突變位點。

一種分子接頭，該分子接頭是呈鑰匙狀結構的核苷酸序列，包括非互補環狀序列、互補雙鏈序列和位于互補雙鏈序列5’端的校正標簽，

(1)非互補環狀序列中脫氧尿嘧啶dU兩側序列包含

CACACGTCTGAACTCCAGTCACdUACACTCTTTCCCTACACGACG；

(2)互補雙鏈序列3’端含有能夠與隨機堿基互補配對的延伸區且3’端經化學修飾為具有防止核酸酶降解的功能；

(3)互補雙鏈序列5’-3’依次為保護堿基、酶切識別堿基、4-12個隨機堿基。

(4)校正標簽5’→3’由保護堿基和4-12個隨機堿基組成，且5’端經化學修飾為具有防止核酸酶降解的功能。

在一種實施方式中，所述非互補環狀序列長度為42-54bp，所述互補雙鏈序列長度為10-22bp。

在一種實施方式中，所述校正標簽5’端經磷酸基團修飾；所述互補雙鏈序列3’端倒數第一個堿基與倒數第二個堿基之間硫化修飾。

在一種實施方式中，校正標簽中為8個隨機堿基。

在一種優選的實施方式中，分子接頭序列為:

PHO-5’-TTCTACAGTACNNNNNNNNAGATCGGAAGAG.....CACACGTCTGAACTCCAGTCACdUACACTCTTTCCCTACACGACG....CTCTTCCGATC*T-3……