[發(fā)明專利]一種用于制備6?氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分離純化與固定化耦合方法

有效

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• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN106967704B
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設計）人: 王旭東;修志龍;董悅生;王啟斌
• 申請（專利權）人: 山西新國大醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/84
• 分類號: C12N9/84;C12N11/00;C12P37/06
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司11283
• 代理人: 嚴政,劉依云

1.一種用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分離純化與固定化耦合方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)制備含有青霉素酰化酶粗酶液和無機鹽的無機鹽混合溶液，該含鹽混合溶液中所述無機鹽的濃度為0.15-0.3g/mL；

其中，所述無機鹽混合溶液的pH為5-8；

(2)將步驟(1)所得無機鹽混合溶液與叔丁醇混合，然后進行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素酰化酶的下相溶液組成的三相分配體系；

其中，所述無機鹽混合溶液與叔丁醇的體積比為1：0.2-1.5；

(3)向步驟(2)所得下相溶液中加入載體進行青霉素酰化酶的固定化；

其中，所述下相溶液的酶活為50-150IU/mL，若高于150IU/mL用水稀釋至上述范圍。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在步驟(1)中，所述無機鹽混合溶液中無機鹽的濃度為0.2-0.3g/mL。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，在步驟(1)中，所述無機鹽為水溶性磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和鹵化物中的一種或多種。

4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述無機鹽為水溶性磷酸鹽和/或硫酸鹽。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述無機鹽為水溶性磷酸鹽。

6.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，在步驟(1)中，所述青霉素酰化酶粗酶液為經細胞破碎后未處理的用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶粗酶液，或者為經細胞破碎后去除菌體等固體雜質后的用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶粗酶液。

7.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，所述青霉素酰化酶粗酶液的酶活為50-300IU/mL。

8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，所述分相的方式為離心分相，該分相溫度為0-40℃、離心力為500-5000g、時間為2-60min。

9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，所述分相的方式為靜置分相，該分相溫度為4-30℃、時間為0.1-4h。

10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述步驟(2)的過程還包括：從所述上相溶液中回收叔丁醇并循環(huán)用于與無機鹽混合溶液相混合的過程中。

11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在步驟(3)中，補加磷酸鹽至無機鹽占總體系的濃度為0.2-0.45g/mL。

12.根據(jù)權利要求1或11所述的方法，其中，在步驟(3)中，所述載體的加入量為總酶活與載體重量之比為500-1000IU/g。

13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中，所述載體為環(huán)氧基載體或活化的氨基載體。