[發(fā)明專利]Tp53基因敲除的動物模型的構建方法及其短肽

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710225708.0
• 申請日: 2017-04-07
• 公開（公告）號: CN108690839B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 沈月雷;張美玲;白陽;周小飛;姚佳維;蘇幼紅;李沖;杜吉超;趙會珍
• 申請（專利權）人: 北京百奧賽圖基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京瀚方律師事務所 11774
• 代理人: 姜瑩

本發(fā)明提供一對短肽、一對轉錄激活子樣效應因子、一對DNA載體，本發(fā)明所述的短肽能夠對大鼠Tp53基因進行準確、高效的打靶，獲得Tp53基因敲除大鼠。本發(fā)明還提供了一種敲除Tp53基因的方法以及一種Tp53基因敲除的動物模型的構建方法，由此得到的大鼠可用于腫瘤相關的研究，包括腫瘤分子生物學研究、腫瘤疾病研究和致癌性檢驗等，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一對短肽、一對轉錄激活子樣效應因子及敲除Tp53基因的方法、構建Tp53基因敲除的動物模型的方法。

背景技術

全世界范圍內針對人類不同疾病進行治病機理研究和藥物開發(fā)從未停止，但由于受到人類自身倫理和技術實現的限制，很多研究不能在人類自體上直接進行，而需要在與人類相近的動物體上進行實驗。目前在腫瘤生物學研究中最常使用的是移植性腫瘤動物模型和誘導性腫瘤動物模型。但移植性腫瘤模型制備過程要求很高，需要無菌操作，且腫瘤細胞形態(tài)、染色體含量等對模型效果影響較大；而誘導性模型由于需要使用化學物質或病毒進行誘發(fā)，制瘤周期、類型、誘導時間及惡性程度和個體差異方面都有很大差異。

相比之下，自發(fā)性腫瘤模型具有獨特的優(yōu)點：首先是自發(fā)性腫瘤通常與人類所患的腫瘤更為相似，有利于將動物實驗結果推用到人；其次是這類腫瘤發(fā)生的條件比較自然，有可能通過細致觀察和統(tǒng)計分析而發(fā)現原來沒有發(fā)現的環(huán)境的或其它的致癌因素，可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發(fā)生上的作用。目前常見的自發(fā)性腫瘤模型比較少，主要是利用近交系動物在一定年齡內可發(fā)生一定比率的某種自發(fā)性癌癥的特點，培育了一些小鼠自發(fā)腫瘤模型。但這種制備方法周期長，大多數模型只發(fā)生單一腫瘤，且不容易同時獲得大批病程相似的自發(fā)瘤動物，限制了自發(fā)性腫瘤模型在研究中的應用。

TP53基因是(tumor protein p53)是目前發(fā)現的與腫瘤相關性最高的一種抑癌基因，且常與其他的基因協(xié)同作用，是多種腫瘤的分子標志物。TP53基因位于人類染色體17p13上，編碼393個氨基酸的P53蛋白。P53蛋白自1979年發(fā)現以來，一直都是生物學領域中研究熱度最高的蛋白。P53蛋白包括3個主要的結構域：N末端反式激活位點中間的DNA結合區(qū)域和c末端寡聚位點；是細胞生長、增殖和損傷修復的重要調節(jié)因子，在細胞處于應激狀態(tài)時可被誘導表達，當細胞受到各種理化或生物因素的影響致使DNA受損時，P53蛋白使細胞停止于G1/S期，讓細胞修復損傷而重新進入細胞周期，如損傷未能修復則促進細胞衰老或凋亡。現有研究表明TP53基因突變或缺失現象與50％以上的人類腫瘤有關聯，攜帶有TP53突變型基因的人類個體表現出較高的癌變傾向，這種遺傳性的癌癥易感性綜合征被稱為李弗勞梅尼綜合癥(Li-Fraumeni Syndrome)。此外，還有研究表明動脈粥樣硬化的發(fā)生可能與Tp53基因表達較低有關。

就Tp53基因相關的動物模型而言，目前已有多種Trp53基因缺失和多種點突變小鼠，且廣泛應用于腫瘤研究及尋找癌癥治療方法當中。已有研究表明，這些小鼠模型通常都能正常發(fā)育，與未發(fā)生Trp53基因突變或缺失的野生型小鼠相比，這些小鼠模型在任何時間段內發(fā)生各種腫瘤的速度都要快得多。其中，Trp53–/–小鼠平均出現腫瘤的年齡是4.5個月，到了10月齡時所有的Trp53–/–小鼠都會死于癌癥。

大鼠作為嚙齒類模式動物，具有比小鼠更大的體型和與人類更類似的生理學特征，已經成為人疾病相關基礎研究和藥物開發(fā)不可或缺的動物模型。與小鼠相比，大鼠更適合于心血管疾病、神經系統(tǒng)疾病、代謝系統(tǒng)疾病等的研究。尤其是在腫瘤研究方面，大鼠癌癥易感模型的體形大，生理結構更接近人類，預期大鼠腫瘤模型具有更長的荷瘤生存期，腫瘤生長的體積可以更大，彌補小鼠模型先天的不足。但是，由于胚胎干細胞提取和培養(yǎng)方法在大鼠上還不成熟，長期以來利用傳統(tǒng)方法制備大鼠基因敲除模型比較困難，在腫瘤研究方面，大鼠癌癥易感模型較少。