[發明專利]一種甘薯莖尖離體培養及組培苗病毒檢測的方法

在審

• 申請號: 201710213822.1
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106973790A
• 公開（公告）日: 2017-07-25
• 發明（設計）人: 王立國;王剛;李燕;李建軍;高翔;張嘉
• 申請（專利權）人: 天津豐華裕隆農業發展有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12Q1/70
• 代理公司: 天津市新天方有限責任專利代理事務所12104
• 代理人: 張強

技術領域

本發明涉及甘薯組培苗病毒檢測領域，尤其涉及一種甘薯莖尖離體培養及組培苗病毒檢測的方法。

背景技術

甘薯是無性繁殖作物，大田種植容易受羽狀斑駁病毒(SPFMV)、花椰菜花葉狀病毒(SPCLV)、潛隱病毒(SPLV)和煙草花葉病毒(TMV)的侵染，導致種性退化，抗性降低，產量和品質下降。我國多數種植區的田間植株病毒感染率為60％-70％，有的甚至達90％，每年導致甘薯減產幅度達29％。目前尚無對病毒完全抗性的品種和徹底免疫的方法，也無特效藥劑，采用莖尖脫毒技術仍然是防治甘薯病毒病、恢復優良種性、提高產量和品質的根本方法。因此對甘薯莖尖進行離體培養以及對組培苗的病毒檢測成為防治甘薯病毒的研究重點。

發明內容

本發明旨在解決現有技術的不足，而提供一種甘薯莖尖離體培養及組培苗病毒檢測的方法。

本發明為實現上述目的，采用以下技術方案：

一種甘薯莖尖離體培養及組培苗病毒檢測的方法，具體步驟為：

(1)材料采集與消毒

于6月份剪取田間生長旺盛的甘薯苗頂芽，切去葉片，自來水沖洗40-50min，用無菌濾紙吸干水分，置于超凈工作臺上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒5min，最后用無菌水沖洗7-8次，備用；

(2)莖尖剝離與培養

在雙目解剖鏡下，將消毒后的甘薯頂芽用注射器針尖剝去外層葉片，僅留1-2個葉原基，將5-6個大小為0.1-0.2mm的莖尖接種在初代培養基上進行培養，培養基中蔗糖為30g/L，瓊脂為6.0g/L，pH為5.8，培養溫度為25℃，光照強度2000-3000lx，光照時間12h/d，培養40天，得到組培苗；

(3)組培苗病毒檢測

采用指示植物針刺汁液沾接法進行病毒檢測：在巴西牽牛初生健康葉上，用滅菌注射器刺孔，然后將待測的甘薯葉片、葉柄及幼莖包扎在一起擠出汁液，沾接在針刺孔上，并以滅菌水及已知帶毒薯液同樣接種作為陰性對照和陽性對照，置于30℃防蟲網室內遮蔭保濕培養；接種后20天連續觀察記載癥狀，根據指示植物癥狀，在所有沾接的指示植物中只要有一株表現典型癥狀，該樣品即為陽性；根據檢測結果淘汰帶毒苗，保留脫毒苗。

莖尖剝離與培養過程中初代培養基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L。

組培苗病毒檢測過程中沾接的指示植物表現的典型癥狀為新生葉出現系統性明脈、黃脈，以后發展為花葉或皺縮。

本發明的有益效果是：本發明提供了一種甘薯莖尖離體培養及組培苗病毒檢測的方法，甘薯脫毒成功率提高，病毒檢測準確度高，對防治甘薯病毒病提供了一種有效的檢測手段。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明：

實施例1：

一種甘薯莖尖離體培養及組培苗病毒檢測的方法，具體步驟為：

(1)材料采集與消毒

于6月份剪取田間生長旺盛的甘薯苗頂芽，切去葉片，自來水沖洗40min，用無菌濾紙吸干水分，置于超凈工作臺上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒5min，最后用無菌水沖洗7次，備用；

(2)莖尖剝離與培養

在雙目解剖鏡下，將消毒后的甘薯頂芽用注射器針尖剝去外層葉片，僅留1個葉原基，將5個大小為0.1mm的莖尖接種在初代培養基上進行培養，培養基中蔗糖為30g/L，瓊脂為6.0g/L，pH為5.8，培養溫度為25℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，培養40天，得到組培苗；

(3)組培苗病毒檢測

采用指示植物針刺汁液沾接法進行病毒檢測：在巴西牽牛初生健康葉上，用滅菌注射器刺孔，然后將待測的甘薯葉片、葉柄及幼莖包扎在一起擠出汁液，沾接在針刺孔上，并以滅菌水及已知帶毒薯液同樣接種作為陰性對照和陽性對照，置于30℃防蟲網室內遮蔭保濕培養；接種后20天連續觀察記載癥狀，根據指示植物癥狀，在所有沾接的指示植物中只要有一株表現典型癥狀，該樣品即為陽性；根據檢測結果淘汰帶毒苗，保留脫毒苗。

莖尖剝離與培養過程中初代培養基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L。

組培苗病毒檢測過程中沾接的指示植物表現的典型癥狀為新生葉出現系統性明脈、黃脈，以后發展為花葉。

實施例2：

一種甘薯莖尖離體培養及組培苗病毒檢測的方法，具體步驟為：

(1)材料采集與消毒