[發(fā)明專利]一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710206866.1 | 申請日： | 2017-03-31 |
| 公開（公告）號： | CN106967804A | 公開（公告）日： | 2017-07-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 羅達龍;黃林杰;黃琳;覃藍;陳學松 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗所 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務所(普通合伙)44295 | 代理人： | 蔡國 |
| 地址： | 543000 廣西壯族*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 檢測 蓮蓉 制品 蕓豆 成分 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種蕓豆成分的檢測方法，尤其是一種熒光PCR技術(shù)檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，屬于化學檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
近年來，由于蓮子價格的不斷攀升，不少廠家為了節(jié)約成本會用蕓豆餡料冒充蓮蓉餡料。蕓豆內(nèi)除含有維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分外，還含有一種對人體有害的成分——血球凝集素，該成分經(jīng)高溫烹調(diào)后可被破壞。但是如果在蕓豆加工過程中，烹調(diào)時間短或翻炒不均勻，致使蕓豆不熟，可引起食物中毒。蕓豆在消化吸收過程中會產(chǎn)生過多的氣體，造成脹肚。故消化功能不良、有慢性消化道疾病的人應盡量少食。還有一些對豆類蛋白敏感人群，如誤食豆制品，可能會引起過敏性皮炎或嚴重的會產(chǎn)生休克。這些不適宜食用蕓豆類食品的人群若誤食沒有標示有蕓豆成分的蓮蓉月餅，可能會造成不可預計的嚴重后果。
蕓豆的檢測依據(jù)國家標準GB/T 23814-2009蓮蓉制品中蕓豆成分定性PCR檢測方法，該方法為普通PCR法，主要過程為通過特異性基因序列擴增后用凝膠成像的方式鑒別，此法步驟繁瑣，干擾因素較多，不利于批量檢測。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，該方法反應快速、特異性強、靈敏度高、結(jié)果清晰，更適合實驗室的批量和快速檢測蓮蓉制品中蕓豆成分。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：
一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，依次包括下述步驟：
1)引物與探針設(shè)計合成
熒光PCR檢測上游引物：ATGAATTGTACGGTGAAGGATGG；
下游引物：GGACTGTAAACAAACACAGGTAGC；
探針：FAM-5’-TCGCAGTCTCGTTGTCACCTCCA-3’-BHQ1，；
2)樣品制備
將蕓豆樣品去皮烤干后用粉碎機打成粉末，其他物種樣品均用粉碎機打碎后取樣用于DNA的提取，蓮蓉月餅樣本取月餅餡料用于DNA提取；
取含1％蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進行10倍逐級稀釋，使蕓豆在混合樣品中的含量為1％、0.1％、0.01％，用于重量靈敏度的測定；
3)DNA提取
將含有1％蕓豆的樣品、純蕓豆樣品、隨機抽取五批蓮蓉月餅，取樣量均為40±2mg，采用迪澳的植物基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行，用OSE-260型微量分光光度計測定DNA濃度；
4)實時熒光PCR反應
實時熒光PCR采用25μL反應體系：10×PCR Buffer 2.5μL，脫氧核糖核苷三磷酸1μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，上、下游引物各0.07μL，探針0.05μL，Taq酶0.3μL，50％甘油0.2μL，模板DNA 5μL，補水至25μL；PCR反應條件：95℃預變性3min，95℃變性5s，55℃退火60s，同時收集熒光，進行45個循環(huán)；
5)實時熒光PCR的特異性試驗
選取白蕓豆、紅蕓豆、花蕓豆、黑蕓豆、大豆、蓮子、玉米、紅薯、小麥、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋的DNA作為PCR的模板，以去離子水為陰性對照模板，進行實時熒光PCR擴增，檢測熒光引物的特異性；
6)實時熒光PCR的靈敏度試驗
取白蕓豆提取出的DNA模版進行稀釋至1ng/μL，然后再進行一系列梯度稀釋，將系列稀釋的DNA模版進行熒光PCR擴增，測試熒光PCR法的檢測靈敏度；取含1％蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進行10倍系列稀釋，使蕓豆在混合樣品中的含量相當于1％、0.1％、0.01％，作為PCR反應得模板，進行實時熒光PCR擴增，測試方法的重量靈敏度；
7)蕓豆PCR擴增
普通PCR反應體系：2×Es PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，去核糖核酸酶水7.5μL，模板DNA3μL；PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，35個循環(huán)后，72℃延伸5min；
普通PCR擴增反應結(jié)束后，PCR擴增產(chǎn)物以2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并記錄結(jié)果。
優(yōu)選的，所述的一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，所述的脫氧核糖核苷三磷酸濃度為2.5mmol/L。
優(yōu)選的，所述的一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，所述的MgCl2濃度為25mmol/L。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢：
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