[發明專利]一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法

在審

• 申請號: 201710206866.1
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106967804A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 羅達龍;黃林杰;黃琳;覃藍;陳學松
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區梧州食品藥品檢驗所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙)44295
• 代理人: 蔡國

1.一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，其特征在于，依次包括下述步驟：

1)引物與探針設計合成

熒光PCR檢測上游引物：ATGAATTGTACGGTGAAGGATGG；

下游引物：GGACTGTAAACAAACACAGGTAGC；

探針：FAM-5’-TCGCAGTCTCGTTGTCACCTCCA-3’-BHQ1；

2)樣品制備

將蕓豆樣品去皮烤干后用粉碎機打成粉末，其他物種樣品均用粉碎機打碎后取樣用于DNA的提取，蓮蓉月餅樣本取月餅餡料用于DNA提取；

取含1％蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進行10倍逐級稀釋，使蕓豆在混合樣品中的含量為1％、0.1％、0.01％，用于重量靈敏度的測定；

3)DNA提取

將含有1％蕓豆的樣品、純蕓豆樣品、隨機抽取五批蓮蓉月餅，取樣量均為40±2mg，采用迪澳的植物基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行，用OSE-260型微量分光光度計測定DNA濃度；

4)實時熒光PCR反應

實時熒光PCR采用25μL反應體系：10×PCR Buffer 2.5μL，脫氧核糖核苷三磷酸1μL，MgCl₂3μL，上、下游引物各0.07μL，探針0.05μL，Taq酶0.3μL，50％甘油0.2μL，模板DNA 5μL，補水至25μL；PCR反應條件：95℃預變性3min，95℃變性5s，55℃退火60s，同時收集熒光，進行45個循環；

5)實時熒光PCR的特異性試驗

選取白蕓豆、紅蕓豆、花蕓豆、黑蕓豆、大豆、蓮子、玉米、紅薯、小麥、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋的DNA作為PCR的模板，以去離子水為陰性對照模板，進行實時熒光PCR擴增，檢測熒光引物的特異性；

6)實時熒光PCR的靈敏度試驗

取白蕓豆提取出的DNA模版進行稀釋至1ng/μL，然后再進行一系列梯度稀釋，將系列稀釋的DNA模版進行熒光PCR擴增，測試熒光PCR法的檢測靈敏度；取含1％蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進行10倍系列稀釋，使蕓豆在混合樣品中的含量相當于1％、0.1％、0.01％，作為PCR反應得模板，進行實時熒光PCR擴增，測試方法的重量靈敏度；

7)蕓豆PCR擴增

普通PCR反應體系：2×Es PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，去核糖核酸酶水7.5μL，模板DNA3μL；PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，35個循環后，72℃延伸5min；

普通PCR擴增反應結束后，PCR擴增產物以2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并記錄結果。

2.根據權利要求1所述的一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，其特征在于，所述的脫氧核糖核苷三磷酸濃度為2.5mmol/L。

3.根據權利要求1所述的一種檢測蓮蓉制品中蕓豆成分的方法，其特征在于，所述的MgCl₂濃度為25mmol/L。