[發明專利]一種用于檢測C?kit基因K642E突變位點的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201710199027.1
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106868178A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 李鵬;王碩;張曉飛;張鳳龍
• 申請（專利權）人: 西安醫臻生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京創遇知識產權代理有限公司11577
• 代理人: 呂學文,朱紅濤

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于檢測C-kit基因K642E突變位點的引物、探針及試劑盒。

背景技術

C-kit原癌基因位于4號染色體長臂，基因全長約80kb，由21個外顯子組成。C-kit的mRNA長5185bp，其開放式閱讀框長2931bp，編碼976個氨基酸殘基的跨膜蛋白分子，即跨膜酪氨酸激酶受體C-kit蛋白。KIT蛋白分子量為145kD左右，是Ⅲ型酪氨酸激酶跨膜受體家族成員，由含五個Ig樣基序的胞外區(結合配基，1-519位氨基酸)、較短的跨膜區(傳導信號，520-543位氨基酸)和含酪氨酸激酶活性的胞漿區(544-976位氨基酸)組成。

C-kit基因異常在肢端和粘膜部位黑素瘤中最常見。這些特點為黑素瘤個體化治療奠定了理論基礎。高加索人種黑素瘤中BRAFV600E突變率最高，最近開發的多種針對突變的向藥物，在部分臨床試驗中己經取得了令人鼓舞的療效。而亞洲人種與高加索人種不同，其最主要的黑素瘤類型是肢端黑素瘤，這一類型黑素瘤最顯著的異常基因是C-kit基因，其中與C-kit基因相關的傳導路徑SCF/C-kit途徑是指當與其配體干細胞生長因子(SCF)結合后，引起C-kit同源二聚體化及胞裝區的酪氨酸激酶活化，使得特定酪氨酸發生自酸化，通過PI3K-AKT途徑活化，從而來調控細胞生長、增殖、凋亡、遷移及粘附。目前認為SCF/C-kit途徑在人類惡性腫瘤中的作用機制主要包括以下兩個方面：1.C-kit基因異常導致不依賴SCF配體的C-kit受體活化；2.SCF的自分泌和旁分泌途徑對C-kit受體的異常刺激。

現己在胃腸間質瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)、白血病、神經母細胞瘤等多種腫瘤發生過程中發現存在C-kit的持續活化，并且酷氨酸激酶抑制劑-甲酸伊馬替尼也己成功運用于GIST的臨床治療中。已經明確大部分GIST的kit基因蛋白可獲得性功能突變表達蛋白CD117，從基因方面上，大部分的GIST均存在C-kit基因的活化突變，并保持獨立性傳導激活。即C-kit蛋白可以在無任何配體相結合的情況下保持持續性的激活自身酪氨酸激酶，從而導致人肥大細胞增生，最終形成人肥大細胞增生病和GIST的發生。隨著人們對GIST基因突變研究的不斷深入，C-kit基因突變直接涉及到GIST的發生、發展，因此，C-kit基因突變已經成為GIST發生的主要機制。對于病變局限、可手術切除的GIST，仍首選外科手術R0切除。對于術后復發、轉移，無法完全切除的患者，分子靶向藥物甲磺酸伊馬替尼的應用為其提供了全新的治療方案。GIST中C-kit基因突變率約為80％-90％，突變形式多樣，包括替換、缺失和插入重復等。其中位于外顯子11Lys550-Va1560區段的突變最為常見(約70％-80％)，位于外顯子9Ala502-Tyr503區段的6堿基插入重復突變約占5-10％。

目前，檢測C-kit基因突變的主要方法有DNA直接測序法、高分辨率溶解曲線法、ARMS-PCR法。然而，直接測序法靈敏度低，檢測靈敏度只有20％-30％，低靈敏度的檢測會導致漏檢及假陰性的發生。此外，直接測序法實驗操作復雜，檢測效率低、樣品易污染、檢測時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。高分辨率溶解曲線法所使用的儀器較特殊，難以在醫院普及。