[發明專利]COX4I1蛋白87位發生質量偏移的賴氨酸在制備重度少弱精診斷試劑中的用途

有效

• 申請號: 201710198192.5
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN107037172B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 楊靜華;趙涵;李翠玲;陳子江
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N33/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 王志坤

技術領域

本發明涉及醫學和分子診斷技術領域，具體涉及一種COX4I1蛋白87位發生質量偏移的賴氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精診斷試劑中的用途。

背景技術

不孕不育已成為全世界范圍內的生殖健康問題，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年來呈上升的趨勢。造成男性不育的主要原因是少精弱精癥。根據世界衛生組織標準規定，如果a級精子數<25％，(a+b)級精子數<50％，且精子活率低于60％的話，就可診斷為弱精子癥。少精子癥是指精液中的精子數目低于正常具有生育能力男性的一種病癥，當男性的精子在每毫升低于2千萬時，就為少精子癥。

目前關于精子蛋白質組的研究有很多。Saraswat等利用UPLC-MS的方法在人類精子中定量了667個蛋白，并且分析出了20個健康人和弱精癥患者精子中的差異蛋白(Saraswat M,Joenvaara S,Jain T et al.Human Spermatozoa Quantitative Proteomic Signature Classifies Normo-and Asthenozoospermia.Molecular&cellular proteomics:MCP,16(1),57-72(2017).)。最新更新的人類精子蛋白質組共6198個蛋白(Amaral A,Castillo J,Ramalho-Santos J,Oliva R.The combined human sperm proteome:cellular pathways and implications for basic and clinical science.Human reproduction update,20(1),40-62(2014).)。Gaigai Wang等利用高分辨質譜在人類精子中鑒定出4675個蛋白(Wang G,Guo Y,Zhou T et al.In-depth proteomic analysis of the human sperm reveals complex protein compositions.Journal of proteomics,79,114-122(2013).)。絡氨酸磷酸化對于精子的運動、獲能、超激運動等過程重要作用。Chying-Chyuan Chan等通過對20組正常人和弱精癥患者的精子進行蛋白質組學分析發現有12種包括TUBGCP2在內的蛋白發生了過磷酸化(Chan CC,Shui HA,Wu CH et al.Motility and Protein Phosphorylation in Healthy and Asthenozoospermic Sperm.Journal of proteome research,8(11),5382-5386(2009))。

非編碼氨基酸包括翻譯后修飾和氨基酸突變，是調控蛋白功能和結構的重要方式，因此將疾病狀態下異常的或者數量變化極大的非編碼氨基酸作為疾病的生物標志物，進而用于診斷疾病的進程具有重要意義。但目前還未有關于非編碼氨基酸作為與重度少弱精子疾病相關的生物標志物的報道。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的提供一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選與應用。本發明首先利用NanoHPLC-MS/MS質譜系統和非標記定量蛋白質組學方法對多組重度少弱精疾病的精子蛋白非編碼氨基酸進行了深度的質譜分析；然后利用非限定氨基酸蛋白質修飾分析方法對質譜數據進行搜索，再經過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常和病人精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白非編碼氨基酸位點，從而將其作為重度少弱精癥的分子標志物。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供了一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選方法，包括如下步驟：

(1)提取精子細胞全蛋白；

(2)將精子細胞全蛋白采用凝膠電泳分離，切膠酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品；

(3)將步驟(2)的樣品采用納流液相色譜分離，經納流液相色譜分離后的樣品再進行質譜檢測，采集質譜數據；