[發(fā)明專利]一種22個短串聯(lián)重復(fù)序列復(fù)合擴(kuò)增方法及其試劑盒

在審

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• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106906292A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李成濤;張素華;邊英男;李莉;林源;闕庭志;趙珍敏;柳燕;劉希玲
• 申請（專利權(quán)）人: 司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所31272
• 代理人: 黨蕾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域，涉及檢測人類基因組中具有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記基因，尤其涉及一種22個STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)基因座和1個性別基因座的復(fù)合擴(kuò)增方法及其試劑盒。

背景技術(shù)

短串聯(lián)重復(fù)序列(簡稱STR)也稱為微衛(wèi)星或簡單序列重復(fù)(SSR)，是一類廣泛存在于真核生物基因組中的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，核心序列為2-6個堿基重復(fù)單位。STR基因座數(shù)量大，分布廣泛，約占整個基因組的3％(International Human Genome Sequencing Consortium，2001)，而且多態(tài)性高，其多態(tài)性主要源自核心序列重復(fù)次數(shù)在個體間的差異，并且這種差異在遺傳過程中遵循孟德爾遺傳規(guī)律。因此，STR擴(kuò)增檢測技術(shù)被廣泛用于法醫(yī)學(xué)個體識別、親緣鑒定和群體遺傳學(xué)研究。

目前STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)是法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定的主要技術(shù)手段，在世界各地的DNA實驗室得到了廣泛應(yīng)用(《Forensic DNA Typing》second edition，John Butler)。早期的STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在一個反應(yīng)體系中擴(kuò)增10個左右的STR基因座，隨著應(yīng)用的廣泛和數(shù)據(jù)比對的增加，10個基因座提供的信息不能滿足要求，國內(nèi)外的廠家開發(fā)出新的更多基因座的產(chǎn)品，比如美國ABI公司的AmpFlSTR Identifiler試劑盒和美國Promega公司的16試劑盒都是15個STR基因座加性別決定基因座。國內(nèi)也有類似的產(chǎn)品，比如公安部二所的DNATyper15能夠同時實現(xiàn)15個STR基因座擴(kuò)增(DNATyper15基因座的研究與選擇，葉健等，《刑事技術(shù)》，2007年03)。

但是，近年來隨著DNA鑒定的應(yīng)用越來越廣泛，特別是在司法鑒定領(lǐng)域涉及的復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定中，由于參照樣本的缺失，客觀上要求檢測更多的、多態(tài)性更好的STR基因座以提供更多的遺傳信息。為了便于各實驗室間的數(shù)據(jù)比較，目前各廠商開發(fā)的試劑盒大多包括了美國CODIS標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的13個核心基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX)，在此基礎(chǔ)上，研究開發(fā)出更多的適合中國人群的STR基因座具有重要意義。由于目前法醫(yī)DNA實驗室普遍具有能夠檢測五色熒光的遺傳分析儀，為了避免各STR基因座的排列擁擠、某一基因座稀有等位基因型的出現(xiàn)會造成與相鄰基因座等位基因的交錯，引起分型錯誤等隱患，目前最廣泛的五色熒光STR試劑盒仍以20個左右的基因座位為主。同時，在法醫(yī)學(xué)實踐中對試劑盒獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量要求也日益提高，一方面不僅需要每個檢測基因座的峰形清晰準(zhǔn)確而且不能出現(xiàn)雜峰和非特異的偏離峰帶；另一方面還要求可以直接擴(kuò)增不同樣品材料(比如：血濾紙片、唾液卡片、FTA卡等材料)，而不必對材料進(jìn)行預(yù)處理，最后還要求擴(kuò)增的時間盡量縮短。目前傳統(tǒng)的STR檢測試劑盒擴(kuò)增時間在3至4小時左右，如果能將擴(kuò)增時間控制在1.5小時內(nèi)完成將大大提高檢測效率和試劑盒性能。

因此，司法鑒定領(lǐng)域需要具有一個反應(yīng)擴(kuò)增較多的基因座、提供較多的信息、具有更好兼容性和更快擴(kuò)增速度的STR復(fù)合擴(kuò)增體系，其對于滿足司法鑒定的需求具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，建立了一種一次檢測22個STR基因座和一個性別基因座的復(fù)合擴(kuò)增方法及其試劑盒，這些STR基因座既包含了目前國內(nèi)外各個生產(chǎn)商所采用的19個常染色體STR基因座，又包括了2個在中國人群具有良好法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值的STR基因座，還包括了1個Y染色體STR基因座，通過合理的設(shè)計和排布，進(jìn)而提高分析多個STR基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的可靠性和穩(wěn)定性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種STR基因座復(fù)合擴(kuò)增方法，包括如下步驟：

1)制作模板DNA；

2)在包含擴(kuò)增引物的擴(kuò)增體系中加入步驟1所得的模板DNA，在預(yù)定反應(yīng)條件的熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)將步驟2)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行完全變性并保持變性狀態(tài)，進(jìn)行電泳檢測，分析所得的檢測數(shù)據(jù)，得到圖譜和基因分型結(jié)果；