[發明專利]一種生長抑素28肽多克隆抗體及其制備方法

在審

• 申請號: 201710197032.9
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN107014991A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 趙肅清;梁雨昕;呂瑞;夏娜娜;謝昭生
• 申請（專利權）人: 廣東工業大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明屬于生物制藥和免疫學檢測領域，更具體地，涉及一種生長抑素28肽多克隆抗體及其制備方法。

背景技術

生長抑素28肽是化學合成的一種環狀多肽，其C端含SS-14的完整順序，N端有另外14肽的延伸，其分子順序為：絲—丙—門酰—絲—門酰—脯—丙—甲硫—丙—脯—精—谷—精—賴—SS-14。

與抑制人生長激素釋放的下丘腦激素結構相同，生長抑素28肽(SS-28)是作用比較廣泛的一種神經激素，它的主要作用是抑制垂體生長激素(GH)的基礎分泌，也抑制腺垂體對多種刺激所引起的GH分泌反應，包括運動、進餐、應激、低血糖等，其最初是從豬小腸和牛下丘腦中分離出的。

近年來，隨著動物生理生化理論研究的不斷發展，發現日糧營養水平、飼養管理及環境等外因對動物的生長促進作用最終通過體內神經內分泌系統的整合來實施，生長抑素基因免疫將成為促進動物生長的新途徑。因此，制備出針對生長抑素28肽的抗體，為檢測SS-28基因疫苗或血清的有效性、研究SS-28蛋白或基因疫苗的作用規律、給藥途徑和作用機理等方面提供事實依據和評定標準。

已采用生長抑素28肽與牛血清蛋白(BSA)偶聯制備抗體的報道，但是用BSA作為載體蛋白的不利之處在于，很多實驗用它當做封閉劑和包被抗原的偶聯載體，如果多肽-BSA偶聯物的抗體用于這樣的檢測分析中，通常會出現假陽性。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法。該方法是將羧基活化后的血藍蛋白KLH，人工偶聯到28肽的生長抑素半抗原的氨基，制得的完全抗原作為免疫抗原，免疫兔子，提取血清蛋白得到生長抑素28肽多克隆抗體粗品，經飽和硫酸銨沉淀或辛酸-硫酸銨法純化血清蛋白后，得到生長抑素28肽多克隆抗體。

本發明的另一個目的在于提供一種上述方法制備的生長抑素28肽多克隆抗體。該生長抑素28肽的多克隆抗體是將血藍蛋白KLH作為載體蛋白進行羧基活化，再與生長抑素28肽中的氨基偶聯，作為免疫抗原去免疫兔子，從兔子的血液中提取血清蛋白并純化得到。該生長抑素28肽多克隆抗體具有純度高，免疫性能好，特異性強的優點。

本發明的再一個目的在于提供上述生長抑素28肽多克隆抗體的應用。

本發明上述目的通過以下技術方案予以實現：

一種生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，包括具體步驟如下：

S1.免疫抗原的制備：

(1)將血藍蛋白KLH和生長抑素28肽分別用PBS溶解，

(2)在PBS溶解后的血藍蛋白KLH溶液中加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺并調整pH為7～8，室溫下反應15～30min，得到血藍蛋白KLH處理液；

(3)將PBS溶解后的生長抑素28肽溶液調整pH值為7～8，滴加血藍蛋白KLH處理液中，在室溫狀態下攪拌反應1～3h，PBS透析，冷凍干燥后得到血藍蛋白KLH-生長抑素28肽固體粉末，并于-20℃保存備用；

(4)將血藍蛋白KLH-生長抑素28肽固體粉末用PBS溶解，制得免疫抗原；

S2.免疫：先用免疫抗原和弗氏完全佐劑佐劑混合乳化后，采用頸部多點皮下注射免疫兔子，28天后用免疫抗原和弗氏不完全佐劑加強免疫，每隔14天后再加強免疫，共加強免疫四次；

S3.抗體粗品的制備：在步驟S2中首次免疫28天后和加強免疫7天后分別對兔耳部靜脈取血，所取血液均在4℃下靜置16～24h，離心后取上清液為含有生長抑素28肽多克隆抗體的血清蛋白，即得生長抑素28肽多克隆抗體粗品；

S4.將生長抑素28肽多克隆抗體粗品經提純處理，得到生長抑素28肽多克隆抗體。

優選地，步驟S1中(1)所述血藍蛋白KLH和PBS的質量體積比為1：1mg/mL，所述生長抑素28肽與PBS的質量體積比為1：1mg/mL；步驟S1中(2)所述血藍蛋白KLH、碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的質量比為1：(0.5～1)：(1.5～2)；步驟S1中(4)所述血藍蛋白KLH-生長抑素28肽固體粉末與PBS的質量體積比為1：1mg/mL。

優選地，步驟S2中所述免疫抗原與弗氏完全佐劑的體積比為1：1～2，所述弗氏完全佐劑佐劑與弗氏不完全佐劑的體積比為1～2：1，所述免疫抗原和弗氏不完全佐劑的體積比為1：1。

步驟S4中所述提純的方法包括如下具體步驟：

S11.將血清蛋白用PBS稀釋后，滴加飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液的濃度為50％，攪拌后靜置，離心后取沉淀，