[發明專利]一種生長抑素28肽多克隆抗體及其制備方法

在審

• 申請號: 201710197032.9
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN107014991A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 趙肅清;梁雨昕;呂瑞;夏娜娜;謝昭生
• 申請（專利權）人: 廣東工業大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所44329
• 代理人: 楊曉松

1.一種生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括具體步驟如下：

S1.免疫抗原的制備：

(1)將血藍蛋白KLH和生長抑素28肽分別用PBS溶解，

(2)在PBS溶解后的血藍蛋白KLH溶液中加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺并調整pH為7～8，室溫下反應15～30min，得到血藍蛋白KLH處理液；

(3)將PBS溶解后的生長抑素28肽溶液調整pH值為7～8，滴加血藍蛋白KLH處理液中，在室溫狀態下攪拌反應1～3h，PBS透析，冷凍干燥后得到血藍蛋白KLH-生長抑素28肽固體粉末，并于-20℃保存備用；

(4)將血藍蛋白KLH-生長抑素28肽固體粉末用PBS溶解，制得免疫抗原；

S2.免疫：先用免疫抗原和弗氏完全佐劑佐劑混合乳化后，采用頸部多點皮下注射免疫兔子，28天后用免疫抗原和弗氏不完全佐劑加強免疫，每隔14天后再加強免疫，共加強免疫四次；

S3.抗體粗品的制備：在步驟S2中首次免疫28天后和加強免疫7天后分別對兔耳部靜脈取血，所取血液均在4℃下靜置16～24h，離心后取上清液為含有生長抑素28肽多克隆抗體的血清蛋白，即得生長抑素28肽多克隆抗體粗品；

S4.將生長抑素28肽多克隆抗體粗品經提純處理，得到生長抑素28肽多克隆抗體。

2.根據權利要求1所述生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S1中(1)所述血藍蛋白KLH和PBS的質量體積比為1：1mg/mL，所述生長抑素28肽與PBS的質量體積比為1：1mg/mL；步驟S1中(2)所述血藍蛋白KLH、碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的質量比為1：(0.5～1)：(1.5～2)；步驟S1中(4)所述血藍蛋白KLH-生長抑素28肽固體粉末與PBS的質量體積比為1：1mg/mL。

3.根據權利要求1所述生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S2中所述免疫抗原與弗氏完全佐劑的體積比為1：1～2，所述弗氏完全佐劑佐劑與弗氏不完全佐劑的體積比為1～2：1，所述免疫抗原和弗氏不完全佐劑的體積比為1：1。

4.根據權利要求1所述的生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S4中所述提純的方法包括如下具體步驟：

S11.將血清蛋白用PBS稀釋后，滴加飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液的濃度為50％，攪拌后靜置，離心后取沉淀，

S12.用PBS溶解沉淀后，繼續滴加飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液的濃度為33％，攪拌后離心，沉淀用PBS溶解，透析，凍干保存，所得粉體即為生長抑素28肽多克隆抗體；

或者，

S21.將血清蛋白用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋，滴加辛酸，攪拌，離心取上清液，

S22.上清液用PBS稀釋后，再滴加飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液的濃度為45％，攪拌后離心，得到的沉淀用PBS溶解，透析，凍干保存，所得粉體即為生長抑素28肽多克隆抗體。

5.根據權利要求4所述的生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S11中所述血清蛋白和PBS的體積比為1：8～10，所述血清蛋白和飽和硫酸銨溶液的體積比為1：9～11，所述攪拌的時間為30～60min，所述靜止的時間為16～24h；所述滴加的速率為200～400μL/秒。

6.根據權利要求4所述的生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S12中所述沉淀與PBS的質量體積比為1：5～10mg/ml，所述PBS與飽和硫酸銨的體積比為1：0.6～0.4，所述凍干的溫度為-40～-80℃，所述凍干的時間為10～20h，所述滴加的速率為200～400μL/秒。

7.根據權利要求4所述的生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S21中所述血清蛋白、醋酸-醋酸鈉緩沖液和辛酸的體積比為1：(4～6)：40，所述醋酸-醋酸鈉緩沖液的濃度為40～100mmol/L，所述醋酸-醋酸鈉緩沖液的pH為4.0～5.6，所述滴加的速率為40～80μL/秒。

8.根據權利要求4所述的生長抑素28肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S22中所述上清液和PBS的體積比為1：(1～1.2)，所述上清液和飽和硫酸銨體積比為1：(1.5～2)，所述凍干的溫度為-40～-80℃，凍干的時間為10～20h，所述滴加的速率為200～400μL/秒。