[發(fā)明專利]用非稀有細(xì)胞檢測(cè)稀有細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710186990.6
• 申請(qǐng)日: 2010-10-20
• 公開（公告）號(hào): CN107422127A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P·昆;A·考拉特卡;J·坤肯;D·馬里努茨;X·楊;J·R·史圖爾普納格
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 斯克里普斯研究所;EPIC科學(xué)公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 王永偉,顏芳

本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2010年10月20日，中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?01080057853.9，發(fā)明名稱為“用非稀有細(xì)胞檢測(cè)稀有細(xì)胞的方法”。

發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體涉及醫(yī)學(xué)診斷，更具體地涉及稀有細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的檢測(cè)和分類。

背景信息

未被滿足的重要醫(yī)療需要存在于在細(xì)胞水平上對(duì)上皮癌癥患者的縱向疾病監(jiān)測(cè)。預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和疾病進(jìn)程鑒于自然病程和對(duì)治療壓力反應(yīng)的選擇性選擇過(guò)程對(duì)上皮癌癥患者尤為重要。雖然在對(duì)第一和轉(zhuǎn)移性腫瘤在其各自微環(huán)境中的了解中已有所進(jìn)展，但在對(duì)流體相期間癌癥行為的了解中存在重大障礙，因?yàn)槠浔椴加谘髦胁⒄紦?jù)血流。癌癥的循環(huán)組分其中包含引起未來(lái)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，因此代表引人注目的研究目標(biāo)。

充分表征此固體腫瘤流體相的臨床意義的研究已由于缺少容易獲得的和可靠的鑒定CTC的實(shí)驗(yàn)工具而被阻礙。血液中CTC未知的特征和低且未知的頻率加上難以區(qū)別癌癥上皮細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞，已嚴(yán)重阻礙流體相如何可能具有臨床重要性的研究。理想的流體相活組織檢查應(yīng)在大多數(shù)上皮癌癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量特定CTC群，并保留和向病理醫(yī)師和/或研究人員呈現(xiàn)不僅能計(jì)數(shù)而且能進(jìn)行進(jìn)一步分子、形態(tài)和/或表型分析的形式的CTC。此外，其應(yīng)保留其余稀有群，用于進(jìn)一步分析。

CTC一般——雖然并非一定——是以極低的濃度源自固體腫瘤并進(jìn)入不同類型癌癥患者的血流的上皮細(xì)胞。CTC也被認(rèn)為能夠起源于血液中，在整個(gè)身體中形成小群落。已存在的腫瘤或轉(zhuǎn)移生成的CTC的脫落通常導(dǎo)致第二腫瘤形成。第二腫瘤一般檢測(cè)不到，并導(dǎo)致全部癌癥死亡中的90％。循環(huán)腫瘤細(xì)胞提供第一與轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的關(guān)聯(lián)。其導(dǎo)致這樣的前景：將循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定和表征用于轉(zhuǎn)移性上皮惡性腫瘤的早期檢測(cè)和治療處理。癌癥患者的CTC檢測(cè)提供在早期診斷第一或第二癌癥生長(zhǎng)和確定進(jìn)行癌癥治療的癌癥患者的預(yù)后中有效的工具，這是因?yàn)檫@種患者血液中存在的CTC的數(shù)量和表征已被關(guān)聯(lián)于全部預(yù)后和對(duì)治療的反應(yīng)。因此，CTC充當(dāng)臨床癥狀出現(xiàn)前腫瘤擴(kuò)張或轉(zhuǎn)移的早期指示劑。

雖然CTC的檢測(cè)在癌癥的處理和治療中具有重要的預(yù)后性和潛在的治療性意義，但由于其在血流中隱匿的性質(zhì)，這些稀有細(xì)胞不易被檢測(cè)到。1800年代首次描述了CTC，但是僅近期技術(shù)進(jìn)步允許其可靠的檢測(cè)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的挑戰(zhàn)是其相對(duì)于其他有核細(xì)胞以相對(duì)低的頻率存在，通常低于1:100,000。為彌補(bǔ)該挑戰(zhàn)，檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的大多數(shù)常規(guī)方法依賴于實(shí)驗(yàn)富集方法，由此使CTC優(yōu)先地與其他細(xì)胞組分(例如，非CTC)——最重要的是最近似于CTC的其他有核細(xì)胞——分離。

目前，對(duì)于計(jì)數(shù)/表征CTC應(yīng)用最多的陽(yáng)性富集方法是靶向表面蛋白EpCAM和“CTC芯片”的免疫磁性富集方法。最廣泛用于檢測(cè)CTC的方法，J&J’s Veridex技術(shù)，利用免疫磁性富集。該技術(shù)依賴于腫瘤細(xì)胞群的免疫磁性富集，利用連接于結(jié)合上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的抗體的鐵磁流體，該上皮細(xì)胞粘附分子僅在上皮衍生細(xì)胞上表達(dá)。該方法需要7.5mL血液用于分析，并僅在一些轉(zhuǎn)移性癌癥患者中發(fā)現(xiàn)2個(gè)以上CTC。

微流體或“CTC-芯片”技術(shù)，是另一種用于計(jì)數(shù)/表征CTC的陽(yáng)性富集方法。該方法采用1-3mL血液，其中全血流經(jīng)78,000個(gè)EpCAM涂布的微柱(microposts)。EpCAM+細(xì)胞粘附于該柱，并隨后用細(xì)胞角蛋白CD45和DAPI染色。以該方法，CTC以相對(duì)高的純度被發(fā)現(xiàn)于幾乎所有的轉(zhuǎn)移性癌癥患者中，而未被發(fā)現(xiàn)于健康對(duì)照中。此外，CTC-芯片技術(shù)鑒定出所有患者中的CTC，并且數(shù)量上比兩個(gè)近期出版物所報(bào)道的其他技術(shù)高約10至100倍的因數(shù)。

唯一的常規(guī)應(yīng)用的CTC檢測(cè)技術(shù)基于免疫磁性富集。目前“黃金標(biāo)準(zhǔn)”和FDA認(rèn)可的測(cè)試被稱為并且利用免疫磁性富集步驟分離表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的細(xì)胞。此外，將被確定為CTC的細(xì)胞必須包含核，表達(dá)細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞角蛋白，和具有大于5微米的直徑。該系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)計(jì)數(shù)和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌患者中CTC計(jì)數(shù)的預(yù)后效用；但是，該系統(tǒng)敏感度低，在大多數(shù)患者中沒有發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)極少的CTC。大多數(shù)后續(xù)的CTC技術(shù)已報(bào)道較高的敏感度，并繼續(xù)進(jìn)行富集策略的改變，但是其使可檢測(cè)的事件直接偏向于最初富集步驟所選蛋白質(zhì)充分表達(dá)的事件。

基于標(biāo)準(zhǔn)化的顯微鏡的方法在前也已在乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和肺癌患者的病例研究中被用于鑒定和在形態(tài)上表征和檢驗(yàn)(credential)CTC。