[發(fā)明專利]一種運用分子信標-熔解曲線技術鑒定細菌的試劑盒及其應用

有效

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• 申請日: 2017-03-27
• 公開（公告）號: CN106834520B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設計）人: 任緒義;呂江峰;周靜
• 申請（專利權）人: 杭州迪安生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

本發(fā)明公開了一種用于快速鑒定多種臨床常見細菌的分子信標及試劑盒，屬于微生物檢測技術領域。本發(fā)明提供的分子信標序列SEQ ID.：v6p1、v6p2、v1p1、v1r所示，通過在NCBI的基因序列庫中比對多種臨床常見細菌16s核糖體RNA序列，在標簽序列處設計分子信標，能夠對臨床常見的18種細菌，1種鮑曼不動桿菌、嗜水汽單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、弗氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、單增李斯特菌、奇異變形菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、金色葡萄球菌、沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷菌、噬麥芽窄食單胞菌進行快速鑒定。本發(fā)明還公開了包含上述分子信標的檢測多種細菌的試劑盒，能快速、準確鑒定多種臨床常見細菌。

技術領域

本發(fā)明屬于細菌檢測技術領域，具體涉及細菌快速鑒定試劑盒(分子信標法)；還涉及所述試劑盒中使用的對于細菌16s核糖體RNA具有部分特異性的分子信標探針。

背景技術

病原菌的鑒定一直是臨床微生物室工作的難點和重點之一。目前臨床上廣泛采用細菌分離培養(yǎng)、形態(tài)特征、生化反應以及免疫學等方法對病原菌進行分類鑒定，但這些方法均存在耗時長、特異性差、操作繁瑣等問題，越來越難以滿足現(xiàn)代細菌學研究的發(fā)展要求。雖然全自動微生物分析系統(tǒng)(AMS)在大型醫(yī)院已經(jīng)普及，但其耗材昂貴，耗時仍相對較長。

16s核糖體RNA，簡稱16s rRNA，是原核生物的核糖體30s亞基的組成部分，16srRNA的3′端具有能與mRNA上游AUG起始密碼子結合的Shine-Dalgarno序列，同時也可作為核糖體蛋白質(zhì)結合的架構。由于不同種的細菌和古細菌間的16s rRNA基因是高度保守的，因此16s rRNA常備用于對各種生物進行的系統(tǒng)發(fā)生學方面的研究。16srRNA中同時具有保守的引物結合位點和高變區(qū)(簽名序列)。近年來，隨著微生物遺傳信息數(shù)據(jù)庫的不斷完善，16srRNA已經(jīng)成為臨床微生物學中可用來替代細菌表型的另一種鑒定目標。

將細菌分離培養(yǎng)與PCR及雜交探針、基因芯片等技術手段相結合,具有敏感度高、重復性好等優(yōu)點,但需經(jīng)過PCR擴增，PCR擴增耗時長，且其高靈敏度容易因輕微污染而產(chǎn)生假陽性，擴增后產(chǎn)物所產(chǎn)生的氣溶膠等污染也是一個不容忽視的問題。

16s rRNA鑒定方法基于一種高分辨熔解曲線技術(High resolution meltingcurveanalysis)的臨床細菌的快速檢測技術，通過分子信標對于從細菌中提取出的16srRNA模板的雜交—解鏈分析二者間的堿基互補程度，16s rRNA上的單個堿基差異都會使熔解溫度(MT)發(fā)生浮動，但是由于MT值同時會受到目標序列GC含量及堿基排列的影響。因此分子信標-熔解曲線技術尚未被用于臨床細菌鑒定領域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術問題是提供細菌鑒定用分子信標探針。

本發(fā)明還要解決的技術問題是提供一種運用分子信標-熔解曲線技術鑒定細菌的試劑盒。

本發(fā)明最后要解決的問題是提供上述試劑盒在細菌檢測中的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種細菌鑒定用分子信標，包括如下分子信標探針；

分子信標探針v6p1：5′-FAM-CGGCGG CTCTAGCGTTGTCAAAGGATGTCAAGCTTTGGTAAGGTTC CCGCCG-DAB-3′；

分子信標探針v6p2：5′-FAM-CGCGGGCAGCAAGCTGCTGCCTGTTACCGTTCGACTTGCACCGCG-DAB-3′；

分子信標探針v1p1：5′-Hex-GGCGGCGCTTCTCGACCGAGGCTCGACTTGCATGTATTAGGGCCGCC-DAB-3′；