[發(fā)明專利]高信噪比多探針PCR Taqman探針及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710184261.7
• 申請(qǐng)日: 2017-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN106868170B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭岷雪;馬勇;趙國(guó)棟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州國(guó)科聞普生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 韓飛

本發(fā)明公開了一種多探針PCR Taqman探針，其為標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的一段寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列至少包括一堿基T，淬滅基團(tuán)標(biāo)記在所述堿基T上，熒光基團(tuán)標(biāo)記在淬滅基團(tuán)的上游堿基上，并且與淬滅基團(tuán)距離8～25nt。本發(fā)明通過改變并縮短熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的標(biāo)記位置，并將淬滅基團(tuán)標(biāo)記在探針寡核苷酸序列的堿基T上，可顯著增強(qiáng)淬滅基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的抑制效率，降低背景噪音；尤其是當(dāng)本發(fā)明應(yīng)用于多探針PCR時(shí)，可明顯降低背景疊加噪音，擴(kuò)大信號(hào)區(qū)間，提高信噪比和檢測(cè)的靈敏度，從而提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性，可進(jìn)一步促進(jìn)多探針PCR技術(shù)的發(fā)展，提高檢測(cè)效率，降低反應(yīng)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種高信噪比多探針PCRTaqman探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程的定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)。多探針熒光定量PCR是在同一PCR反應(yīng)體系含有針對(duì)多個(gè)特異的靶序列的多對(duì)探針進(jìn)行PCR反應(yīng)和熒光檢測(cè)。

目前熒光定量PCR采用最多的探針為Taqman探針，該探針為一寡核苷酸，探針的5'端修飾一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端修飾一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí)，探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'端→3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

但是由于Taqman探針的長(zhǎng)度一般在18～45nt之間，因此淬滅基團(tuán)無法完全的吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的熒光，所以在熒光定量PCR的過程中存在一定的背景噪音。而在多重?zé)晒舛縋CR過程中，一個(gè)通道中探針個(gè)數(shù)會(huì)增加到10個(gè)甚至更多，這樣會(huì)導(dǎo)致背景噪音的疊加，從而降低了熒光信號(hào)的信噪比，導(dǎo)致多重?zé)晒舛縋CR在同一熒光通道探針較多的情況時(shí)出現(xiàn)靈敏度降低等檢測(cè)困難的現(xiàn)象。

中國(guó)發(fā)明專利CN200710122376.X公開了一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針及其應(yīng)用。該發(fā)明的探針一改傳統(tǒng)Taqman探針中把熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分別放在探針兩端的設(shè)計(jì)方法，把熒光淬滅基團(tuán)設(shè)計(jì)在探針的中部，同時(shí)在熒光淬滅基團(tuán)兩端各修飾一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，該發(fā)明的探針一分子探針被水解時(shí)可以釋放兩分子熒光，可以增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度，提高檢測(cè)的靈敏度，但是其成本也加倍，并且背景噪音沒有減弱，甚至?xí)鼜?qiáng)，因此開發(fā)一種高信噪比的多重?zé)晒舛縋CR Taqman探針對(duì)于提高多重?zé)晒舛縋CR的靈敏度是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種多探針PCR Taqman探針，其能夠有效降低Taqman探針PCR尤其是多Taqman探針PCR的背景噪音，提高檢測(cè)的靈敏度。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種熒光定量PCR Taqman探針，其為標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的一段寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列至少包括一堿基T，所述淬滅基團(tuán)標(biāo)記在所述堿基T上，以確保淬滅基團(tuán)標(biāo)記的穩(wěn)定性，保證淬滅效果，所述熒光基團(tuán)標(biāo)記在淬滅基團(tuán)的上游堿基上，并且與所述淬滅基團(tuán)距離8～25nt(nt為單鏈核苷酸)，使淬滅基團(tuán)可最大程度上吸收熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光，降低熒光定量PCR背景，但熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的標(biāo)記的距離也不能過近，當(dāng)熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離小于8nt時(shí)，探針上熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)標(biāo)記的位置越近，熒光基團(tuán)被水解釋放后發(fā)射的熒光信號(hào)強(qiáng)度越低，影響結(jié)果檢測(cè)的靈敏度。

優(yōu)選的是，其中，所述寡核苷酸序列的長(zhǎng)度為18～45nt(nt為單鏈核苷酸)，既保證探針與模板結(jié)合效率，又保證淬滅基團(tuán)的淬滅效果。