[發明專利]一種提高蛋白濃度測定準確性的快速測定試劑及其測定方法

有效

• 申請號: 201710182922.2
• 申請日: 2017-03-24
• 公開（公告）號: CN106885778B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 荀恒杰;陳旭;陳剛
• 申請（專利權）人: 依科賽生物科技(太倉)有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;G01N21/82
• 代理公司: 32267 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 馬廣旭

本發明提供了一種提高蛋白濃度測定準確性的快速測定試劑及其測定方法，所述測定試劑包括沉淀試劑，堿性銅試劑和生色試劑。所述沉淀試劑能夠將蛋白樣品溶液中的蛋白沉淀出來，且蛋白沒有損失；所述堿性銅試劑溶解沉淀的蛋白并與蛋白的肽鍵結合；所述生色試劑，在未與蛋白結合的堿性銅試劑被還原后與所述生色試劑反應，產生特定范圍的吸收波長，最佳吸收波長的吸收值與蛋白樣品溶液中的蛋白量有良好的線性關系，可以用于常規生物技術蛋白實驗特別是用于生物醫藥中蛋白藥物濃度的精確測定，應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于生物技術的應用領域，涉及到一種提高蛋白濃度測定準確性的快速測定試劑及其測定方法，特別但不限于應用于生物制藥中蛋白藥物樣品濃度的精確定量。

背景技術

蛋白濃度測定是蛋白生物技術(包括生物制藥中蛋白藥物)實驗中一項基本實驗內容，它是進行SDS-PAGE電泳、Western Blot、Elisa、蛋白酶活性測定、蛋白二維電泳、蛋白質譜、蛋白分子量測定、蛋白測序等實驗的基本前提，比較常見的為蛋白濃度測定方法包括Bradford法，Lowry法，BCA法等。

根據汪家政的蛋白質技術手冊一書所述，Bradford試劑在酸性條件下，與蛋白的結合能力與蛋白中所含賴氨酸、精氨酸和組氨酸所帶電荷相關，同時范德華力和疏水作用力也參與了蛋白與染料的結合。由于各種蛋白所含有賴氨酸、精氨酸和組氨酸的數量變化比較大，導致不同樣品的變異系數明顯偏大，同時Bradford試劑與蛋白混合后，必須在10分鐘內完成吸收值得測量，否則隨著時間的延長，染料復合體以及蛋白-染料復合體會逐漸沉降，導致吸收值明顯降低，這樣在做大量蛋白樣品定量時，它所具有的缺點就更加明顯，同時也容易受到蛋白樣品溶液中存在的各種離子或非離子或兩性去污試劑的干擾。Lowry法是蛋白在堿性溶液中肽鍵與Cu²⁺螯合，形成蛋白-銅復合物，在還原劑磷鉬酸-磷鎢酸試劑的作用下，產生藍色的化合物，藍色深淺與蛋白濃度呈線性關系，該方法適用于脂類含量較高的樣品的測定，也能夠耐受較高濃度的去污試劑，但易受硫酸銨、Tris、甘氨酸和各種硫醇的影響，而且顏色深淺隨不同蛋白而產生變化，標準曲線不是嚴格的直線形式，且專一性較差。BCA法基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白將Cu²⁺還原為一價銅，BCA與一價銅螯合，產生藍紫色復合物并在562nm有吸收峰。吸收值與蛋白濃度的線性關系較好。該方法主要是蛋白中的肽鍵參與了反應，同時也與蛋白中的半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、色氨酸含量有關，由于不同蛋白中氨基酸的組成不同，Bradford法吸收值的變異系數在不同蛋白樣品中明顯大于BCA法，同時在常規的蛋白提取、純化、保存的過程中，通常是需要加入低濃度的還原試劑(DTT，巰基乙醇等)，以保持蛋白的穩定，避免蛋白的變性和沉淀，但是還原試劑存在會導致BCA法中的二價銅被還原，吸收值明顯增加，從而測定的蛋白樣品濃度明顯偏高。

以上的三種用于蛋白濃度測定方法，要么受蛋白氨基酸組成成分的影響，不同蛋白的變異系數較大，而且顏色的穩定性也較差；要么受各種干擾試劑的影響，蛋白濃度與吸收值得線性關系不好；要么受蛋白溶液中所添加還原試劑的影響，蛋白濃度測定的結果產生偏差。

發明內容

發明目的：為了克服以上不足，本發明的目的在于提供一種蛋白樣品精確定量的快速測定試劑及其測定方法，以克服現有技術在蛋白樣品定量過程中，由于不同樣品蛋白氨基酸組成差異，蛋白樣品中存在的各種干擾試劑，蛋白與試劑形成的有色復合物穩定性差所造成的對蛋白樣品定量所產生的偏差。

技術方案：為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供了一種提高蛋白濃度測定準確性的快速測定試劑，包括

沉淀試劑，所述沉淀試劑能夠將蛋白樣品溶液中的蛋白沉淀出來，且蛋白沒有損失，并可進一步去除位于上清中的各種化學試劑；

堿性銅試劑，所述堿性銅試劑溶解沉淀的蛋白并與蛋白的肽鍵結合；