[發(fā)明專利]一種凍存保護液及其應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710180717.2
• 申請日: 2017-03-24
• 公開（公告）號: CN106942200A
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發(fā)明（設計）人: 張雷;李旺;韓香華;魏志璋;羅曉玲
• 申請（專利權）人: 深圳市合一康生物科技股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種凍存保護液，特別用于玻璃化凍存免疫細胞和臍血的凍存保護液及其方法和應用。

背景技術

傳統(tǒng)的細胞低溫保存方法有連續(xù)慢速降溫法、程序性降溫法和梯度降溫法等，其主要的區(qū)別在于細胞的降溫速率及各個降溫階段停留的時間不同，所采用的冷凍保護劑成分及濃度也有區(qū)別，文獻報道在這些方法中目前低溫保存細胞存活率最高的為程序性降溫法，人們采用類似的降溫技術低溫保存細胞已取得了一定的進展。但是，傳統(tǒng)的低溫保存方法有很多局限性，如無法避免冷凍過程中細胞內冰晶的形成，且操作過程繁瑣，需要昂貴的程序降溫儀。

玻璃化凍存法是近年來發(fā)展起來的一項新的冷凍技術，玻璃化冷凍技術是利用體積微小的冷凍承載工具，在極快速降溫過程中，使高濃度的冷凍保護液由液態(tài)轉變?yōu)轲ざ群芨叩念愃撇Ａ拥墓虘B(tài)，并以這種狀態(tài)在低溫下長期保存。其超快的降溫速率可以避免細胞內冰晶的形成，極大的降低了冷凍過程中的細胞損傷。玻璃化凍存法可以保持原有細胞的活性和完整性，并能降低其抗原性，其冷凍保護劑的組分及配方已可用于保存人體的組織和器官，到目前為止，已經成功保存了人的精子、卵母細胞、胚胎、紅細胞、胚胎干細胞、造血干細胞、胰島等。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供一種玻璃化凍存免疫細胞和臍血的凍存保護液及相應的凍存方法，采用本發(fā)明的凍存保護液具有良好的玻璃化凍存效果；采用此法凍存的細胞，在復蘇后存活率相比于傳統(tǒng)凍存方法有顯著增加；而且細胞復蘇后有更高的活細胞比率。

本發(fā)明的目的之一在于提供一種存活率更高的玻璃化凍存免疫細胞和臍血的凍存保護液。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種玻璃化凍存免疫細胞和臍血的方法和應用。

實現本發(fā)明第一個目的的技術方案是：一種玻璃化凍存免疫細胞和臍血的凍存保護液，凍存保護液是在基礎培養(yǎng)基中加入胎牛血清、人血清白蛋白、二甲亞砜、乙二醇、甲酰胺和海藻糖；各組分的用量如下（v/v為體積比）：

二甲亞砜 2.5～3.5mol/L

乙二醇 2.5～3.5mol/L

甲酰胺 2.0～3.0mol/L

海藻糖 0.5～1.0mol/L

胎牛血清 15～25%（v/v）

人血清白蛋白 0.2%-3%。

各組分的優(yōu)化用量如下：

二甲亞砜3.2 mol/L

乙二醇3.2 mol/L

甲酰胺2.5 mol/L

海藻糖0.5 mol/L

胎牛血清20%（v/v）

人血清白蛋白1% 。

所述基礎培養(yǎng)基為RPMI 1640 培養(yǎng)液或者其他可替代的培養(yǎng)基。

實現本發(fā)明另一目的的技術方案是：一種玻璃化凍存免疫細胞和臍血的凍存保護液用來凍存細胞的方法，包括以下步驟：

①制備凍存保護液；

②制備細胞；

③用步驟①制備的凍存保護液懸浮細胞并注入凍存麥管；

④直接放入液氮中進行玻璃化凍存。

步驟①中制備凍存保護液的方法如下：在基礎培養(yǎng)基RPMI 1640 培養(yǎng)液中依次加入胎牛血清、人血清白蛋白、海藻糖、乙二醇、甲酰胺，過濾除菌，加入二甲亞砜，放入低溫保存，優(yōu)選為4℃保存。

各組分用量為：

二甲亞砜 2.5～3.5mol/L

乙二醇 2.5～3.5mol/L

甲酰胺 2.0～3.0mol/L

海藻糖 0.5～1.0mol/L

胎牛血清 15～25%（v/v）

人血清白蛋白 0.2%-3%。

各組分的優(yōu)化用量如下：

二甲亞砜3.2 mol/L

乙二醇3.2 mol/L

甲酰胺2.5 mol/L

海藻糖0.5 mol/L

胎牛血清20%（v/v）

人血清白蛋白1% 。

步驟②中制備細胞，分為免疫細胞和臍血兩種，分別來源于人的外周靜脈血和臍血，通過密度梯度離心去除紅細胞，獲得白膜層細胞，洗滌并用無血清培養(yǎng)液重懸，收集細胞。

步驟③中將用步驟②制備的細胞進行離心，用步驟①制備的凍存保護液懸浮細胞并調整密度至2～10×10⁶/ml，注入凍存麥管，并密封。

步驟③中注入細胞的凍存麥管進行編號，按照步驟④迅速放入液氮罐中進行玻璃化冷凍。

本發(fā)明所述的制備的凍存保護液也可用于各種來源的其他免疫細胞和臍血的玻璃化凍存。