[發(fā)明專利]一種檢測EGFR基因突變的方法及試劑盒

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• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106929582A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郎秋蕾;周小川;李璐璐;方超;梁洪;林彬;張瑞靜
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州聯(lián)川基因診斷技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)的基因突變診斷領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測EGFR基因突變的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

近年來利用分子靶向藥物治療腫瘤的技術(shù)高速發(fā)展，該法不同于傳統(tǒng)化療，其利用靶向藥物通過與腫瘤細(xì)胞的特征性位點結(jié)合，干預(yù)控制腫瘤細(xì)胞生長增殖的基因信號傳導(dǎo)通路；不會對正常細(xì)胞造成損傷，具有巨大的優(yōu)勢。

人類表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是由1186個氨基酸構(gòu)成的分子量大小在170kD的跨膜糖蛋白，主要位于細(xì)胞膜上，在大部分正常上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞外結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及主要由酪氨酸激酶組成的細(xì)胞內(nèi)區(qū)等，屬于受體酪氨酸激酶(TKI)家族。EGFR可以激活酪氨酸激酶，從而打開下游的信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子通路等，最終介導(dǎo)細(xì)胞分化、生存、遷移、侵襲、粘附和細(xì)胞損傷修復(fù)等一系列過程，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡抑制及血管生成中發(fā)揮著重要作用。因此，EGFR已經(jīng)成為相關(guān)腫瘤尤其是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)靶向治療的一個重要靶點。

EGFR基因突變是重要的癌癥驅(qū)動因子，主要集中于編碼酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的外顯子18-21區(qū)。19號外顯子的突變主要是第746-752位密碼子的堿基缺失突變，導(dǎo)致外顯子編碼的4個高保守氨基酸(Leu-Arg-Glu-Ala)序列丟失；21號外顯子多為點突變，主要是第858位密碼子出現(xiàn)T-G轉(zhuǎn)換，使該位點的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔喎Q為L858R。18號外顯子G719X突變和20號外顯子T790M突變也是較常見的突變，這幾類突變占比90％以上。

目前臨床上EGFR的靶向治療主要基于小分子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)和單克隆抗體兩種機(jī)制。其中基于EGFR-TKI機(jī)制的吉非替尼(Gefitinib，商品名易瑞沙)和厄洛替尼(Erlotinib，商品名特羅凱)，是目前腫瘤患者最有效的靶向藥物。與此同時，腫瘤細(xì)胞具有多樣性，并非所有腫瘤細(xì)胞都具有一樣的特征性位點，導(dǎo)致這些靶向藥物并非對所有患者有效。已有大量研究表明，EGFR基因外顯子的突變是此類靶向藥物對患者有效的必要前提。

由于EGFR-TKI類的靶向藥物價格昂貴，如果病人不攜帶EGFR突變而服用此類藥物，不但耽誤病情而且還造成巨額經(jīng)濟(jì)損失。因此，用藥前篩查腫瘤患者的EGFR突變是保證安全、有效用藥的必要流程，也是未來腫瘤個體化治療的發(fā)展方向。美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)已經(jīng)將EGFR基因檢測作為非小細(xì)胞肺癌等的靶向藥物選用的前提列入了腫瘤臨床實踐指南。

目前常用的基因突變檢測方法主要是測序法與ARMS-PCR法。ARMS法可同時檢測腫瘤組織中多種已知的常見突變，具有靈敏度高(可測出低至1％水平的突變)，操作簡單，檢測快速等優(yōu)點；然而對于取樣方便的血液樣本如循環(huán)腫瘤細(xì)胞，腫瘤DNA含量過低，ARMS-PCR法不足以對其進(jìn)行檢測，同時該類試劑盒檢測成本過高限制了在臨床上的推廣及應(yīng)用。測序法是基因突變及多樣性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，具有技術(shù)成熟、結(jié)果準(zhǔn)確和全面等優(yōu)點，相比ARMS法檢測費用低廉并且還能測出未知突變；而目前測序法主要的不足在于操作復(fù)雜，且檢測靈敏度過低，只有突變達(dá)到大于10％甚至20％才能被可靠檢出。

基于上述原因，本發(fā)明涉及到設(shè)計一套新型的多重PCR引物，并引入分子標(biāo)簽技術(shù)，對于DNA片段的模板進(jìn)行唯一性標(biāo)記并擴(kuò)增，同時結(jié)合二代測序技術(shù)，開發(fā)了一種對于組織樣本以及血液樣本通用型的、簡便的，對EGFR基因的突變進(jìn)行測序和分析的方法以及其檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供了一種基于多重PCR及高通量測序技術(shù)的EGFR基因突變的檢測方法及試劑盒，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中步驟繁雜，檢測靈敏度低、檢測周期長的問題。

在本發(fā)明的一方面，提供一種檢測EGFR基因突變的引物，其中通用引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的特異性引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的特異性引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的特異性引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的特異性引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。