[發明專利]小蒼蘭花葉病毒RT?LAMP檢測引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710167613.8
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106947831A
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: 樊榮輝;黃敏玲;鐘淮欽;葉秀仙;羅遠華
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙)35212
• 代理人: 宋連梅

技術領域

本發明涉及一種小蒼蘭花葉病毒RT-LAMP檢測引物及其檢測方法。

背景技術

小蒼蘭花葉病毒(Freesia mosaic virus，FreMV)是危害小蒼蘭最嚴重最常見的病毒之一。小蒼蘭花葉病毒侵染小蒼蘭，會影響小蒼蘭觀賞和利用價值，造成花色雜，花朵數量驟減，植物生長不良，嚴重影響其觀賞價值，發病嚴重時，甚至造成種球的退化，失去再利用的價值，已經成為小蒼蘭大規模生產的主要限制因素。目前，小蒼蘭病毒尚無特別有效的化學防治方法，培育和栽培無病毒苗成為防治小蒼蘭病毒的根本措施，在無毒苗培育過程中，經常需要對母本及脫毒苗進行病毒檢測，建立快速、靈敏的檢測技術顯得尤為重要。

目前，病毒檢測主要有電鏡觀察法，酶聯免疫法、PCR檢測法等幾種方法。傳統的電鏡法費時費力，需要有經驗的專業人員才能鑒定，酶聯免疫法是目前較常用的一種方法，但也存在靈敏度不高的缺陷，靈敏度更高的PCR技術已成為常規檢測手段，但由于實驗設備要求高，不利于向基層檢驗檢疫部門推廣。

發明內容

本發明要解決的技術問題之一，在于提供一種小蒼蘭花葉病毒RT-LAMP檢測引物。

本發明是這樣實現的：一種小蒼蘭花葉病毒RT-LAMP檢測引物，包括以下兩引物對：

外引物F3：5'-GACGAGGTGCGATACCAAGC-3'，

外引物B3：5'-CCTTCAATTTTGCCAACCTTGG-3'；

內引物FIP：

5'-CACTCCTTGCTTTTCGCCTTCGCGAATTCAGCAACTTGACGCTGGGGCT-3'；

內引物BIP：

5'-GAGCGCGAAATTGCAAAGAATAGCGGAATTCTTGCTCGTGAACCCACATCCAC-3'。

本發明要解決的技術問題之二，在于提供一種小蒼蘭花葉病毒RT-LAMP檢測方法。

本發明是這樣實現的：一種小蒼蘭花葉病毒RT-LAMP檢測方法，利用所述的引物對小蒼蘭花葉病毒進行RT-LAMP擴增檢測，其中反應體系和反應程序具體如下：

反應體系：2.5μL 10×Bst buffer、4μL MgSO₄(25mmol/L)、4μL甜菜堿(5mmol/L)、4μL dNTPs(2.5mmol/L)、1μL Bst聚合酶(8U/μL)、2μL的引物FIP(20μmol/L)、2μL的引物BIP(20μmol/L)、0.5μL的引物F3(10μmol/L)、0.5μL的引物B3(10μmol/L)、2μL ddH₂O、2.5μL cDNA，反應體系的總體積為50μL；

反應程序為：65℃60min，80℃5min。

本發明的優點在于：具有擴增快速高效、特異性好、操作簡便、不需要特殊儀器等優點，有較高的應用價值，在基層和現場檢測中有很好的應用前景。

附圖說明

下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的說明。

圖1是本發明中FreMV的RT-LAMP擴增產物的1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2是本發明中酶切產物的1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3是本發明中RT-LAMP擴增檢測FreMV靈敏度實驗結果的1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4是本發明中RT-PCR擴增檢測FreMV靈敏度實驗結果的1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5是本發明中RT-PCR擴增檢測FreMV特異性實驗結果的1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

一種小蒼蘭花葉病毒RT-LAMP檢測方法，具體如下：

步驟100：根據GenBank公布的FreMV較保守的CP基因序列(CP基因序列如SEQ ID NO：5)為靶標基因應用LAMP引物設計軟件primer explorer4.0(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計引物，得到針對6個區域的4條特異性引物，并由上海生工生物工程有限公司合成上述兩對特異性引物。應用DNA鏈置換聚合酶(Bst DNA polymerase),在恒溫條件下快速對靶基因進行RT-LAMP擴增。

其中，各引物對具體為：

外引物F3:5'-GACGAGGTGCGATACCAAGC-3'(序列如SEQ ID NO：1)，