[發明專利]一種人血漿中他達拉非的定量分析方法

在審

• 申請號: 201710159580.2
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN108627576A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 姜宏梁;張楊
• 申請（專利權）人: 武漢宏韌生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞

本發明公開了一種人血漿中他達拉非的定量分析方法，包括如下步驟：（1）標準工作溶液的配制；（2）樣品處理；（3）標準曲線制作；（4）定量分析：將試驗樣品按照步驟（3）的方法處理，并按步驟（3）所得的標準曲線方程計算，得到試驗樣品中他達拉非的濃度。本發明應用液質聯用技術(HPLC?MS/MS)測定人血漿中他達拉非的濃度，準確定量人血漿中他達拉非的濃度，通過色譜柱、溶解液、流動相、質譜條件等的合理選擇，流速、洗脫方式、質譜條件等工藝條件的優化，操作簡便，重復性高，準確性好，可操作性強，可以直接運用于生物等效性中樣品檢測分析。

技術領域

本發明屬于生物分析領域，更具體地，涉及一種應用液質聯用技術(HPLC-MS/MS)對人血漿中他達拉非的定量分析方法。

背景技術

據估計，全世界范圍內有超過1.5億的勃起功能障礙(ED)患者，隨著全球人口老齡化，ED患者的數量還將不斷攀升。他達拉非片是環磷酸鳥苷(cGMP)特異性磷酸二酯酶5(PDE5)的選擇性可逆抑制劑，當性刺激導致局部釋放一氧化氮，PDE5受到他達拉非抑制，使陰莖海綿體內cGMP水平提高，這導致平滑肌松弛，血液流入陰莖組織，產生勃起，如無性刺激。2013年底，禮來在中國推出了每日一次的5mg小劑量口服劑型的希愛力(他達拉非)，相同療效，價格僅萬艾可(西地拉非)的三分之一。中國仿制藥市場強大的需求，既便宜又效果質量不錯的藥品需求可以減輕經濟負擔。開發他達拉非的生物檢測方法并應用于他達拉非的仿制藥一致性評價具有廣闊的前景。

仿制藥一致性評價中，如何確定更好更穩定的進行生物等效性評價，藥物的檢測分析顯得非常重要。他達拉非生物樣品的成分復雜、基體干擾大，同時樣品較難獲得而且量少，被分析物的濃度通常很低，因此對生物樣品分離分析技術提出的要求越來越高，亟需建立一種高靈敏度、高選擇性的他達拉非含量分析方法。

發明內容

本發明針對上述現有技術中的不足，從樣品前處理和檢測技術兩方面著手，提供了一種人血漿中他達拉非的定量分析方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案予以實現的。

一種人血漿中他達拉非的定量分析方法，包括如下步驟：

(1)標準工作溶液的配制：稱取他達拉非，加入體積比9:1的甲醇-二甲亞砜溶液配制成濃度為0.100～5.000mg·mL^-1的他達拉非儲備液，將所述他達拉非儲備液用體積比1:1的甲醇水溶液稀釋成梯度濃度為40.0～40000ng·mL^-1的他達拉非工作溶液；按上述步驟重復一次，配置成梯度濃度為40.0～320000ng·mL^-1的他達拉非平行工作溶液；稱取他達拉非-d3，加入體積比9:1的甲醇-二甲亞砜溶液配制成濃度為0.050～2.000mg·mL^-1的內標儲備液，用體積比1:1的甲醇水溶液稀釋成300～500ng·mL^-1的內標工作溶液；所有儲備液及工作溶液在0～10℃下保存，備用；

取空白人正常血漿，分別加入所述他達拉非工作溶液，混勻，配置成相應梯度的校正標樣，其濃度范圍為2.00～2000ng·mL^-1；取空白人正常血漿，分別加入所述他達拉非平行工作溶液，混勻，配置成相應梯度的質控樣品，其梯度濃度范圍為2.00～16000ng·mL^-1；

(2)樣品處理：取等體積的校正標樣、質控樣品、試驗樣品、空白人血漿和水，往校正標樣、質控樣品、試驗樣品中分別加入等體積的所述內標工作溶液，往空白人血漿和水分別加入等體積的甲醇水溶液；向上述每個混合液中加入乙腈，混勻，離心，轉移上清液至甲醇水溶液中，混勻，將各提取物保存；

(3)標準曲線制作：將步驟(2)得到校正標樣、質控樣品的提取物進行LC-MS/MS分析測定，以他達拉非和內標他達拉非的色譜峰面積比為縱坐標，以人血漿中他達拉非的濃度為橫坐標制作標準曲線；