[發明專利]高通量自動化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒

在審

• 申請號: 201710154008.7
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN106867998A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 高利飛;李振紅;王瑋;于永敏;呂萌萌;李桂林;付光宇;吳學煒;苗擁軍
• 申請（專利權）人: 鄭州安圖生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 鄭州異開專利事務所(普通合伙)41114
• 代理人: 王霞

技術領域

本發明涉及生物化學技術領域，尤其是涉及一種高通量自動化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒。

背景技術

人體氣管、支氣管的內壁都覆蓋著一層粘膜，在粘膜下層含較多的粘液腺和漿液腺。正常情況下，杯狀細胞和腺體分泌少量粘液覆蓋在粘膜層表面，對粘膜起保護作用，可保持氣管粘膜的濕潤，以便把吸入氣管、支氣管內的塵埃顆粒、細菌等粘附住，阻擋其進入肺組織深處。當氣管、支氣管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而發生炎癥時，呼吸道的粘膜充血、水腫，大量炎性細胞浸潤，血管擴張，滲出增加，粘膜層的杯狀細胞和粘膜下層的腺體增生肥大，粘液分泌大量增多，產生一些變性壞死組織細胞，滯留在支氣管內，粘液和這些變性壞死的組織細胞就構成了痰。正常人一般不咯痰或僅有少量泡沫樣痰或粘液樣痰，當呼吸道有病變時，呼吸道粘膜受刺激，分泌物增多，痰也增多。病變包括支氣管擴張癥、肺膿腫、肺結核、肺癌等；此時痰液中就會包含粘液、異物、病原微生物，各種炎癥細胞及壞死脫落的粘膜上皮細胞、腫瘤細胞等成分。痰液中的細菌真菌病毒等病原微生物核酸是呼吸道感染等疾病分子診斷的重要標本。從呼吸道痰液脫落細胞中提取病原物核酸（DNA和RNA)，通過PCR、熒光定量PCR等分子生物學檢測手段進行基因檢測，可用于呼吸道感染的快速診斷。

傳統的痰液病原體核酸提取方法為：用氫氧化鈉消化痰液，然后高速離心收集沉淀，用磷酸緩沖液洗滌沉淀2次，離心收集菌體，再利用高溫煮沸，裂解核酸，然后高速離心，取上清即為制備的核酸。此過程需要反復的離心洗滌，操作非常復雜，容易在消化和提取過程中損失大量核酸，同時雜質去除率低，導致檢測假陰性；而反復離心工作不利于核酸檢測的自動化，且該方法不適用于痰液中病原體RNA的提取，不具有通用性，直接限制了通過痰液進行呼吸道感染等疾病的臨床診斷，降低了痰液這一重要臨床樣本在疾病診斷中的價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高通量自動化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒。

為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：

本發明所述的高通量自動化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒，包括痰液消化試劑，裂解液，磁珠，洗滌液和洗脫液；所述痰液消化試劑為1~6M的 NaOH；所述裂解液是由2~8M的胍鹽、表面活性劑、pH緩沖介質和金屬螯合劑配制而成的pH≤3的酸性溶液。

所述胍鹽可以為異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍、碳酸胍、磷酸胍或硝酸胍等，優選為異硫氰酸胍，可起到抑制RNase 活性，保護核酸不被降解的作用，優選其濃度為4M；所述表面活性劑可以由SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40、十二烷基肌氨酸鈉、CTAB中的一種或兩種以上組合物組成，其濃度為1~20%，優選的表面活性劑為Triton X-100，濃度為10%；所述pH緩沖介質為10~100mM 的Tris-HCl，由鹽酸或醋酸調節至pH≤3，優選pH＜2；所述金屬螯合劑為10~25 mM 的EDTA，用于穩定體系pH值，并除去作為核酸酶活性輔因子的金屬離子。

所述磁珠為磁性復合微粒，由核酸吸附載體和具有超順磁性的磁性納米粒子組成；所述核酸吸附載體為二氧化硅或是用氨基或羧基修飾的聚乙烯醇、多糖、硅樹脂、聚苯乙烯中的一種或兩種以上的混合物；所述超順磁性的磁性納米粒子為Fe、Co、Ni、 Fe₂0₃、Fe₃0₄、Co₂0₃、Co₃0₄中的一種或兩種以上的混合物。

所述洗滌液為檸檬酸鹽緩沖液，或磷酸鹽緩沖液，或75%乙醇的Tris緩沖液，當然也可以采用本領域常用的其他洗滌液。

本發明采用的洗脫液可以為本領域常用的各種洗脫液，如10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0。

本發明的試劑盒在提取痰液樣本中的病原體（包括細菌、病毒、真菌）核酸時無需離心，便于自動化操作；對痰液樣本中的病毒、細菌、真菌DNA和RNA均可提取，更具有通用性；提取過程中無有機毒劑，更加安全；提取核酸的純度高，提高了痰液臨床樣本在疾病診斷中的價值。

本發明試劑盒提取總核酸（包括DNA和RNA）時無需離心，用氫氧化鈉消化痰液后，直接取消化液，將其添加到酸性的裂解液中后直接加磁珠，酸堿中和反應與樣本裂解反應、核酸吸附反應一步完成；特制的核酸溶液能保護核酸DNA和RNA，同時維持適合磁珠核酸吸附的pH環境和高鹽環境；用洗滌液洗滌雜質和殘留的鹽分，洗脫核酸即制備出痰液總核酸（DNA和RNA）。